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Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

One Step TB Green™ PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (製品コード RR096A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 410 μl25 μl
    TaKaRa Ex Taq HS Mix1.2 μl3 μl
    PrimeScript PLUS RTase Mix0.4 μl1 μl 
    PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μl2 μl0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl2 μl0.4 μM*1
    ROX Reference Dye or Dye II(50×)*30.4 μl1 μl
    total RNA 2 μl4 μl*2 
    RNase Free dH2O4.4 μl12 μl 
    Total20 μl*450 μl*4 

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 50 μl反応液あたりtotal RNA 20 pg~200 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

    *3 ROX Reference Dye II(50×)は、ROX Reference Dye(50×)より濃度を低く設定している。Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II(50×)を使用する。
    StepOnePlus および7300 Real-Time PCR System には、ROX Reference Dye(50×)を使用する。

    *4 96ウェルプレート、シングルチューブおよび8連チューブでの反応は50 μl反応系で行う。384ウェルプレートおよびFast System用の96ウェルプレート、8連チューブ(0.1 ml)での反応は20 μl反応系で行う。

  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。

    プログラム
    <Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>
    Stage 1, 2 :逆転写反応
        Reps:1
        42℃ 5分
        95℃ 10秒

    Stage 3:PCR反応
        Reps:40
        95℃  5秒
        60℃ 30~34秒*
    Stage 4:Dissociation Protocol

    <7500 Fast Real-Time PCR System>
    Holding Stage
        42℃ 5分
        95℃ 10秒

    Cycling Stage
        Number of Cycles:40
        95℃  3秒
        60℃ 30秒
    Melt Curve Stage
    StepOnePlusは30秒、7300は31秒、7500は34秒に設定する。

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行なうには、通常95℃10秒で充分です。


  3. 反応終了後、解析を行う。
    反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。*
    * 解析方法は、各リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
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