細胞から直接cDNAを増幅する場合
CellAmp™ Whole Transcriptome Amplification Kit (Real Time) Ver.2（製品コード 3734）
- 下記に示す反応液を調製する。
Cell solution以外のコンポーネントで必要な本数＋α分のMaster mixを調製し、0.2 mlチューブに分注後、Cell solution 0.5 μlを添加するとよい。
使用量 Lysis Buffer 1.25 μl RNase Inhibitor 0.25 μl RT dT Primer 0.1 μl dNTP Mixture 0.1 μl Cell solution*1 0.5 μl RNase Free dH2O 2.8 μl Total 5 μl *1 Cell Solutionの添加量は0.5 μlを上限とし、細胞数の上限は1,000個までとする。
Cell solutionは、細胞から培地を取り除き、PBS（－）で洗浄した後、PBS（－）などで懸濁した溶液を用いる。 - 70℃で1.5分間インキュベートし、細胞を溶解する。
- 2．の反応液が入ったチューブに以下の試薬を加えて、全量を5.6 μlとする。
（2．の反応液以外のコンポーネントでMaster mixを調製し、2．の反応液のチューブに0.6 μlずつ添加すると良い。）
使用量 2．の反応液 5 μl MgCl2 0.3 μl RT Enzyme Mix 2 0.3 μl Total 5.6 μl - cDNA合成反応を行う。
42℃、5 分
85℃、5 秒 - 4．の反応液が入ったチューブにExonuclease I 0.6 μlを加えて、全量を6.2 μlとする。
- Exonuclease I処理を行う。
37℃、15分
80℃、15分 - 6．の反応液が入ったチューブに以下の試薬を加えて、全量を12.2 μlとする。
（6．の反応液以外のコンポーネントでMaster mixを調製し、6．の反応液のチューブに6 μlずつ添加すると良い。）
使用量 6．の反応液 6.2 μl TdT Buffer 1.2 μl dATP 0.2 μl TdT Enzyme Mix 0.45 μl RNase Free dH2O 4.15 μl Total 12.2 μl - poly dA tailを付加する。
37℃、15分
70℃、10分 - 8．の反応液以外のコンポーネントでMaster mixを調製し、新しい0.2 mlチューブに22.5 μlずつ分注する。そこに 8．の反応液を2.5 μl添加し、下記に示す反応液を調製する。
使用量 8．の反応液 2.5 μl 10×Ex Taq Buffe *2 2.5 μl dNTP Mixture（2.5 mM each）*2 2.5 μl PCR Primer Mix 2 0.75 μl TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl）*2 0.25 μl RNase Free dH2O 16.5 μl Total 25 μl *2 TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（製品コード RR006A）を用いる。 - cDNA増幅を行う。
cDNA増幅産物は、1/10から1/100程度に希釈してリアルタイムPCRの鋳型として使用する。最適な添加量は検出目的遺伝子の発現量によって異なるので、適宜調整する。cDNA増幅産物をすぐに使用しない場合は、－20℃保存する。95℃ 1分 1 cycle 50℃ 1分 72℃ 3分 95℃ 30秒 20 cycles 67℃ 1分 72℃ 3分 72℃ 10分
【注意】
本製品で増幅したcDNAを用いてリアルタイムPCRを行う場合、リアルタイムPCR用のプライマーはmRNAの3'末端から約1 kb以内に設計することをお勧めします。
本製品では、cDNAをPCRで均一に増幅するために、1st strand cDNAの合成鎖長が適度な長さになるように調節されています。mRNAの3'末端から離れた位置は、効率よく増幅されない可能性がありますので、ご注意ください。
Perfect Real Timeサポートシステムのプライマーをご使用の場合は、逆転写反応にOligo dT Primerを用いる実験に使用できるプライマー（検索結果のpositionの欄で「dT」のマークがあるプライマー）を選択し、なおかつ増幅位置が、mRNAの3'末端から約1 kb以内にあるものをご使用ください。
CellAmp™ Whole Transcriptome Amplification Kit (Real Time) Ver.2
