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Protocols

QuickPrimer (Real Time)シリーズ

リアルタイムPCR

QuickPrimer (Real Time)シリーズ(製品コード MR101~113、MR201~205、MR207、MR208)
操作の手順は、それぞれのリアルタイムPCR装置で異なりますので、詳しい操作方法はそれぞれの機器に添付されている説明書をご確認ください。
【Thermal Cycler Dice Real Time System (食品環境検査用ソフト)の場合】
(1)ランファイルを新規作成し、“新規測定”画面において解析タイプ≪絶対定量≫を選択する。
(2) 反応条件設定画面でPCR条件を設定する。
初期変性(Hold)
Cycle:1
  95℃ 2分
  3 step PCR
Cycle:35
  95℃ 20秒
  55℃ 20秒
  74℃ 20秒(検出)
Dissociation

(3)"反応開始"ボタンをクリックして反応を開始する。
(4)サンプル設定画面でサンプル情報の設定を行う。
(5)結果解析
反応終了後、“結果/解析”ボタンをクリックする。 二画面の上部にサンプル検出のFAMフィルターでの増幅曲線(左図)を、下部に融解曲線(右図)を表示する。 あわせて、NC(陰性コントロール)、PC(陽性コントロールDNA) での増幅曲線および融解曲線を確認する。
(6)上下いずれかの画面で“データ解析”<テキストレポート>を選択し、“表示項目”<SDM法データ(2nd Derivative Maximum法による解析)>のチェックをはずし、CP法データ(Crossing Point法による解析)の結果を表示する。
(7)“詳細項目”のTm#1、Tm#2にチェックを入れ、<定量値 (CP)(検量線設定時にサンプル濃度を表示)>のチェックを外す。必要に応じて、“詳細項目”より表示する項目を選択する。
注: "Speed"は、Thermal Cycler Dice Real Time System III(製品コード TP950)の場合はNormalに、Thermal Cycler Dice Real Time System II(製品コード TP900)やLite(製品コード TP700)ではFastに設定します。
食品環境検査用ソフトウェアをご使用の場合、Speedの設定は各装置のデフォルト条件のままなので、設定の変更は不要です。
【Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systemの場合】
(1)Experiment Properties画面設定を行う。
 ・ Quantification-Standard Curveを選択する。
 ・ SYBR Green Reagentsを選択し、Include Melt Curveのチェックを確認する。

(2)反応条件を設定し、チューブをセットし、反応をスタートする。
Stage 1:初期変性
  Reps:1
  95℃ 2分
Stage 2:PCR反応
  Reps:35
  95℃ 20秒
  55℃ 20秒
  74℃ 25秒(検出)
  
  Melting


(3)反応終了後、Analysis画面で、増幅曲線および融解曲線を確認し、Tm値を求める。
【StepOnePlus Real-Time PCR Systemの場合】
(1)Experiment Properties画面設定を行う。
 ・Quantification-Standard Curveを選択する。
 ・SYBR Green Reagentsを選択し、Include Melt Curveのチェックを確認する。

(2)反応条件を設定し、チューブをセットし、反応をスタートする。
Stage 1:初期変性
  Reps:1
  95℃ 2分
Stage 2:PCR反応
  Reps:35
  95℃ 20秒
  55℃ 20秒
  74℃ 20秒(検出)
  
  Melting
(3)反応終了後、Analysis画面で、増幅曲線および融解曲線を確認し、Tm値を求める。
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