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Protocols

B. subtilis Secretory Protein Expression System

[参考] エレクトロポレーション法によるB. subtilis RIK1285株の形質転換

B. subtilis Secretory Protein Expression System(製品コード 3380)

B. subtilis Secretory Protein Expression Systemの説明書ではコンピテントセルを用いる形質転換法を紹介しているが、エレクトロポレーション法でもB. subtilis RIK1285株の形質転換が可能である。
以下に概略を紹介する。
エレクトロポレーション用セルの調製
  1. 宿主菌株のグリセロールストックから適量をLBプレートに広げて、37℃で一晩(約16時間)培養する。
  2. 一晩LBプレートで培養した宿主菌株から、1白金耳を20 mlのLB培地に植菌する。一晩(約16時間)、28℃で前培養する。
  3. 前培養液 12 ml を本培養液(LB + 0.5 M sorbitol)200 ml に加え、37℃で本培養を行う。
  4. A660 = 0.85~0.95で本培養を止める(約2時間)。
  5. 氷中に10分間放置する。
  6. 5,000 x g で5分間遠心する。
  7. 氷冷したSolution A (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10% glycerol)を各20 ml使用し菌体を4回洗浄する。
  8. 菌体を0.8 ml のSolution A に懸濁する。
  9. 60 μlずつ分注し、-80℃で保存する。これをエレクトロポレーション用セルとする。
エレクトロポレーション
  1. エレクトロポレーション用セル60 μlを氷中で溶解し、1~1.5 μlDNA溶液(250 ng分)を加える。
  2. 氷冷しておいた0.1 cm cuvetteに、セルおよびDNAの混合液を移し、1~1.5分間放置する。
  3. パルスをかけた後、Solution B(LB + 0.5 M sorbitol + 0.38 M mannitol)を1 ml 加え、37℃で3時間穏やかに振とう培養する。
    ※:例えばBio Rad 社製のMicro Pulserで2 kVに設定してパルスを加える。その際のtime constantは4.2から4.7である。
  4. 培養液をカナマイシン(10 μg/ml)を含むLBプレートにまく。37℃で一晩培養する。

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