効率の良い分泌発現系の構築・スクリーニングに
製品説明
Bacillus subtilisを宿主とする組換えタンパク質の生産は、可溶化発現および分泌発現に優れている。特にS-S結合などの複雑な構造をもつタンパク質に有効である。さらに大腸菌を宿主とした発現系とは異なり、エンドトキシンが産生タンパク質中には混入しない。このような利点がある一方で、異種タンパク質の分泌効率はシグナルペプチドのタイプに大きく影響されることがT. Eggertらのグループによって報告されている。タカラバイオでは、B. subtilisによる効率の良い分泌発現系の構築・スクリーニングを行うためのシステムを開発した。本システムでは、B. subtilis由来の173種類の分泌シグナルペプチドの中から、目的タンパク質の分泌発現に適したシグナルペプチドをスクリーニングすることが可能である。また、B. subtilisのプラスミドはコピー数が非常に少ないため、B. subtilis中でのプラスミド構築が困難であるという問題があるが、本システムのpBE-S DNA はE. coliとB. subtilisのシャトルベクターであり、大腸菌で発現プラスミドを構築することができる。
本システムには、B. subtilisの分泌シグナルペプチドDNAライブラリーであるSP DNA mixture、B. subtilis-E. coliシャトルベクターpBE-S DNAおよびタンパク質発現用宿主B. subtilis RIK1285株が含まれている。SP DNA mixtureは、173種類のB. subtilis由来分泌シグナルペプチドをコードするDNA断片（In-Fusionクローニング用）の混合物である。pBE-S DNAには、B. subtilisにおいて機能するpUB110由来の複製ori（pUBori）とカナマイシン耐性遺伝子（Kanr）、E. coliにおいて機能するpUC由来の複製ori（ColE1 ori）とアンピシリン耐性遺伝子（Ampr）が含まれている。さらに、B. subtilis由来のサブチリシンのプロモーター（aprE promoter）と分泌シグナルペプチド（aprE SP）を含み、その下流にマルチクローニングサイト（MCS）ならびにHisタグ配列が配置されている。MCSに目的遺伝子を挿入したpBE-S DNAを制限酵素Mlu IとEco52 I（Xma III）で切断して線状化した後、Clontech社のIn-Fusionクローニングシステムで、aprE SPの代わりにSP DNA mixture中の173種類の分泌シグナルペプチドDNAのライブラリーを導入することにより（図1参照）、目的タンパク質に適した高分泌発現系のスクリーニングが可能である。なお、MCSは大腸菌コールドショック発現系pColdベクター（製品コード 3360～3365, 3371, 3372）と同じ配列のため、容易に目的遺伝子の乗せ換えを行うことができる。本キットに添付の宿主B. subtilis RIK1285株は、2種類のプロテアーゼ産生能を欠損しており、目的タンパク質の分泌発現に適している。
本システムには、B. subtilisの分泌シグナルペプチドDNAライブラリーであるSP DNA mixture、B. subtilis-E. coliシャトルベクターpBE-S DNAおよびタンパク質発現用宿主B. subtilis RIK1285株が含まれている。SP DNA mixtureは、173種類のB. subtilis由来分泌シグナルペプチドをコードするDNA断片（In-Fusionクローニング用）の混合物である。pBE-S DNAには、B. subtilisにおいて機能するpUB110由来の複製ori（pUBori）とカナマイシン耐性遺伝子（Kanr）、E. coliにおいて機能するpUC由来の複製ori（ColE1 ori）とアンピシリン耐性遺伝子（Ampr）が含まれている。さらに、B. subtilis由来のサブチリシンのプロモーター（aprE promoter）と分泌シグナルペプチド（aprE SP）を含み、その下流にマルチクローニングサイト（MCS）ならびにHisタグ配列が配置されている。MCSに目的遺伝子を挿入したpBE-S DNAを制限酵素Mlu IとEco52 I（Xma III）で切断して線状化した後、Clontech社のIn-Fusionクローニングシステムで、aprE SPの代わりにSP DNA mixture中の173種類の分泌シグナルペプチドDNAのライブラリーを導入することにより（図1参照）、目的タンパク質に適した高分泌発現系のスクリーニングが可能である。なお、MCSは大腸菌コールドショック発現系pColdベクター（製品コード 3360～3365, 3371, 3372）と同じ配列のため、容易に目的遺伝子の乗せ換えを行うことができる。本キットに添付の宿主B. subtilis RIK1285株は、2種類のプロテアーゼ産生能を欠損しており、目的タンパク質の分泌発現に適している。
内容
| SP DNA mixture (0.032 pmol/μl)*1 | 45 μl |
| pBE-S DNA（0.5 μg/μl)*2 | 20 μg |
| B. subtilis RIK1285 (glycerol stock)*3 | 100 μl×2 |
*1 In-Fusionクローニング用の173種類のB. subtilisの分泌シグナルペプチドDNA
*2 形状：TE buffer (pH8.0)
*3 Marburg 168 derivative：trpC2, lys1, aprE Δ3, nprR2, nprE18
保存
－80℃
SP DNA mixtureおよびpBE-S DNAは、－20℃でも保存可能
SP DNA mixtureおよびpBE-S DNAは、－20℃でも保存可能
pBE-S DNAの概略図
図1．pBE-S DNAのベクターマップ
pBE-S DNAのシーケンスデータおよびB. subtilisの分泌シグナルペプチドの配列
本製品以外に必要な試薬（主なもの）
- In-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638943～638944/638947～638949）、In-Fusion HD Cloning Kitシリーズ（製品コード 639633～639635/639642～639644/639648～639650）
- E. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）
- Mlu I（製品コード 1071A）*1
- Eco52 I（Xma III）（製品コード 1039A）*2
- その他の制限酵素
- NucleoSpin Plasmid（製品コード 740588.10/.50/.250）、NucleoSpin Plasmid QuickPure（製品コード 740615.10/.50/.250：終売）などのプラスミド精製キット
- B. subtilis形質転換用試薬
*1 目的遺伝子を挿入したpBE-S DNA（SP DNA mixture 挿入用）の線状化に使用
*2 pBE-S DNAへの目的遺伝子のクローニングに使用
使用上の注意
- 本キットは、In-Fusion Snap Assembly Master MixやIn-Fusion HD Cloning Kitと組み合わせて使用してください。さらに、高効率で形質転換体を得るため、E. coli HST08 Premium Competent Cellsを使用することをおすすめします。
- SP DNA mixture はPCR増幅したDNA fragmentを混合し、調製しています。従って、頻度は低いですがプライマーダイマーなどPCR増幅副産物がクローニングされる場合があります。
関連資料
Protocols
[参考] エレクトロポレーション法によるB. subtilis RIK1285株の形質転換
Application
超耐熱性酵素β-glycosidaseに好適な分泌シグナルペプチドのスクリーニング
BIO VIEW / Clontechniques
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