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Protocols

PrimeScript™ II High Fidelity One Step RT-PCR Kit

標準プロトコール(製品コード R026A/B)

1.下記に示す反応液を調製する。
試薬 使用量 最終濃度
2×One Step High Fidelity Buffer 25 μl
PrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl  
PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR 4 μl  
上流 Primer(20 μM)(センス) 1 μl 0.4 μM
下流 Primer(20 μM)(アンチセンス) 1 μl 0.4 μM
Template RNA*1 *1  
RNase Free dH2O up to 50 μl  

*1 total RNAの場合は10~1000 ngの使用を推奨。
なお、Positive Control RNAの場合は1 μlを使用してください。
2.調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムでRT-PCRを行う。
一般的な反応条件
45℃*2 10 min.
94℃ 2 min.
98℃ 10 sec.
 
30 cycles
60 or 55℃*3 15 sec.
68℃ 10 sec./kb*4

*2 逆転写反応温度
PrimeScript II RTase(PrimeScript II RT Enzyme Mixに含まれる)は、プライミングの特異性が向上しているため、特異性が要求される下流プライマーからの逆転写反応をRNAの分解や酵素の失活の心配のない45℃で反応することができます。
6 kbを超える長鎖増幅の場合には、逆転写反応時間を15 min.にのばすことにより、cDNA合成量が向上する場合があります。
*3 アニーリング温度
プライマーのTm値(下記の式で計算)が55℃をこえる場合
  →60℃に設定
プライマーのTm値(下記の式で計算)が55℃以下の場合
  →55℃に設定
※Tm値計算方法
  Tm値(℃)=[(A、Tの数)×2]+[(G、Cの数)×4]-5
*4 伸長時間は1 kbあたり10 sec.で設定してください。ただし、1 kb未満の場合は10 sec.にしてください。
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