この画面を閉じる

Protocols

MightyAmp™ Genotyping Kit

MightyAmp™ Genotyping Kitの操作方法(製品コード R074A)

1. 組織試料からのDNA抽出
室温で操作を行う。
反応はサーマルサイクラーを利用して行うと便利である。
  1. 組織試料*1を100 μlのExtraction Buffer が入ったPCRチューブに加える。
  2. 【注意】Extraction Bufferが沈殿物を形成している場合は、加温して(~60℃)静かに撹拌し沈殿物を溶かしてください。
  3. Proteinase K 1 μlをチューブに添加する。
  4. 60℃で5分間インキュベートした後、98℃で2分間処理し、室温まで温度を下げる*2
  5. 室温で試料が落ちる程度に軽く遠心し、上清をExtraction Buffer抽出液(PCRの鋳型)とする*3

  6. *1持ち込む試料の目安量
    マウス尾2 mm
    マウス耳 5 mm2
    マウス臓器30 mm3
    植物の葉 5 mm2
    *2 4℃にすると沈殿物を形成するため、操作中は室温(25℃)を保ってください。
    *3保存する場合は、上清を別のチューブに移して-20℃で保存してください。
    PCRに使用する前には室温に戻し沈殿物がないことを確認してください。
2. 一般的なPCR 反応液組成(50 μl 反応系)
 使用量最終濃度
2×MightyAmp Buffer25 μl
Primer 115 pmol0.3 μM
Primer 215 pmol0.3 μM
Extraction Buffer抽出液*4≦2.5 μl 
MightyAmp DNA Polymerase1 μl1.25 U/50 μl
滅菌水up to 50 μl 

*4抽出液は必ず室温にしてから使用してください。また、抽出液のPCR反応液への持ち込み量は反応液の1/20量以下を推奨します。その他の試薬は氷上で取り扱ってください。
3. PCR条件
伸長温度を68℃に設定した3 step PCRが標準条件である。

[3 step PCR]
98℃2 min.*5  
   
98℃10 sec.
30~40 cycles
60℃15 sec.
68℃1 min./kb

[オプション:2 step PCR]
98℃2 min.*5  
   
98℃10 sec.
30~40 cycles
68℃1 min./kb

*5 強力なホットスタート抗体を使用しているため、必ず98℃、2 min.の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。
4. 増幅産物の電気泳動
添付の5×Loading DyeとPCR反応液を1:4の割合で混合後、電気泳動ゲルにアプライする。
MightyAmp DNA Polymeraseを用いて増幅したPCR産物を電気泳動する場合は、TAE Bufferの使用を推奨する。TBE Bufferを使用すると、泳動パターンが裾広がりになり、きれいな泳動結果が得られない場合がある。
この画面を閉じる