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Protocols

HRV 3C Protease

溶液での切断

小スケールでの目的タンパク質切断の至適化試験
  1. 1.5 ml マイクロチューブに以下の反応液を調製する。
    Target protein各10, 20, 50, 100 μg
    10×HRV 3C Cleavage Buffer5 μl
    HRV 3C Protease1 μl(1 U)
    精製水up to 50 μl

    HRV 3C Protease と目的タンパク質の混合比率(unit/μg)は、それぞれ1 : 10、1 : 20、1 : 50、1 : 100となる。
    反応のコントロールとして、Cleavage Control Fusion Proteinを切断する場合は、1~10 μgを用いる。
  2. 4℃で反応する。標準の反応時間は16 時間であるが、長時間反応を避けたい場合は、次のようにサンプリングを行い、反応時間も同時に検討する。上記反応液から、1、3、6、16時間後に反応液10 μlを取り、10 μlの2×SDS Sample Bufferと混合する。SDS-PAGEを行うまで、混合液は-20℃で保存する。

  3. SDS-PAGEを行う。コントロールとして、未消化の目的タンパク質も同時にSDS-PAGEに供する。SDS-PAGEの結果から、目的タンパク質を切断するために必要な酵素量、反応時間を決定する。
スケールアップと目的タンパク質の回収
目的の融合タンパク質が、N末にHisタグ、HNタグ配列を持っている場合、金属キレート樹脂を用いて、切断後の目的タンパク質を回収することが可能である。以下は、TALON Metal Affinity Resin(製品コード 635501)を使用した例を示す。
  1. 上記の反応液を、スケールアップして調製する。
    至適化試験において決定した量比になるように目的タンパク質およびHRV 3C Proteaseを加える。

  2. 4℃で、至適化試験で決定した時間の反応を行う。

  3. 必要量の10×HRV 3C Clevage Bufferを10倍に希釈して、1×HRV 3C Clevage Bufferを作製し、4℃においておく。以下の操作は4℃で行う。

  4. 適当量のTALON Metal Affinity Resinを、1×HRV 3C Cleavage Bufferで平衡化して50% Slurryの状態にする。
    TALON Metal Affinity Resinのタンパク質結合容量は、約5~15 mg/ml Resinである。

  5. 50% SlurryのTALON Resinに2. の反応液を加える。穏やかに4℃で1時間転倒混和する。

  6. 5. のResin を含む溶液を、700×gで5分間遠心し、上清を回収する。HRV 3C ProteaseおよびタグはResinに吸着するため、目的タンパク質が上清に回収される。または、5. のResinを含む溶液を、TALON 2 ml Disposable Gravity Column(製品コード 635606)などに充填し、Wash画分を回収する。

  7. SDS-PAGEによる確認を行う。


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