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Protocols

TB Green® Fast qPCR Mix

LightCycler 96/LightCycler 480システムを用いる場合の操作方法

TB Green Fast qPCR Mix(製品コード RR430S/A/B)
※ 各機種の取扱説明書に従って操作してください。
  1. 下記に示す PCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    TB Green Fast qPCR Mix(2×)10 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μl0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl0.4 μM*1
    template(<100 ng)*22 μl
    滅菌精製水6.4 μl
    total20 μl

  2. 反応を開始する。

    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。(PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。)


    <LightCycler 96>
    シャトルPCR標準プロトコール
    Stage 1:初期変性
      94℃、30秒  20℃/秒
      1サイクル
    Stage 2:PCR反応
      94℃、5秒  20℃/秒
      60℃、10秒  20℃/秒
      40サイクル
    Stage 3:融解曲線分析
      95℃、0秒  20℃/秒
      60℃、15秒  20℃/秒
      95℃、0秒0.1℃/秒

    <LightCycler 480>
    シャトルPCR標準プロトコール
    Denature
      94℃、30秒  (Ramp Rate 4.8℃/sec.)
      1サイクル
    PCR
      Analysis Mode:Quantificatio
      94℃、5秒  (Ramp Rate 4.8℃/sec.)
      60℃、10秒  (Ramp Rate 2.5℃/sec.、Acquisition Mode:Single)
      40サイクル
    Melting
      Analysis Mode:Melting Curves
      95℃、5秒  (Ramp Rate 4.8℃/sec.)
      60℃、1分  (Ramp Rate 2.5℃/sec.)
      95℃  (Ramp Rate 0.11℃/sec.、Acquisition Mode:Continuous、Acquisitions:5 per℃)
      1サイクル
    Cooling   50℃、30秒(Ramp Rate 2.5℃/sec.)
      1サイクル

    ※使用上の注意
    本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
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