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Protocols

AAVpro® Concentrator

150 mlのAAVベクター溶液からの濃縮

AAVベクター溶液が150 ml未満の場合は、AAVベクター溶液の液量に応じてステップ1、2の試薬添加量を変更してください。(例:AAVベクター溶液が75 mlの場合、Concentrating solution AおよびBの添加量を1/2量に変更してください。)
  1. 150 mlのAAVベクター溶液にConcentrating solution A を8 ml添加し(約20倍希釈)、ボルテックスで十分に懸濁する。
    【注】容量の大きな遠心機がない場合は、2. に進む前に遠心可能な容量の遠心管に分けてから2. の操作を行ってください。
  2. 40 mlのConcentrating solution Bを添加し、ボルテックスで十分に混合後、遠心管に移し、4℃で一晩静置する。
  3. 2. の遠心管の底部に白い沈殿があることを確認する。
    【注】サンプルにEDTAが含まれている場合には白い沈殿が見られない場合もありますが、そのまま4.に進んでください。
  4. 2,000×g、4℃で50分間遠心した後、慎重に上清を除去する。
  5. 沈殿に8 mlのDissolving solutionを添加し、ピペッティングで均一になるように懸濁する。懸濁後、新しい遠心管に移す。
  6. 15秒間ボルテックス後、室温で15分間静置する。その後、さらに15秒間ボルテックスする。
  7. 懸濁液を2,000×g、4℃で15分間遠心後、上清を新しい遠心管に移し、さらに2,000×g、4℃で15分間遠心する。その後、慎重に上清を回収し、Millex-HV 0.45 μmで濾過する。
    【注】1個のMillex-HV 0.45 μmでは、目詰まりによりすべての溶液を濾過できない場合があります。その場合は新しいMillex-HV 0.45 μmを使用してください。
  8. 7.で得られたAAVベクター溶液をAmicon Ultra-15, 100 kDa に添加し、2,000×g、15℃で10分間遠心する。AAVベクター溶液が1.5 ml以下になったことを確認する。
    【注1】スイングローターの使用を推奨します。固定アングルローターを用いる場合は、メンブレンパネルが上を向くようバケットに設置してください。
    【注2】AAVベクター溶液が1.5 ml以下になっていない場合は、カップ内に残ったAAVベクター溶液をピペッティングで均一にし、さらに遠心操作を実施してください。
  9. ろ液を除去後、10.5 mlのWashing solutionをカップ内に添加する。ピペッティングで溶液を均一化し、2,000×g、15℃で10分間遠心する。AAVベクター溶液が1.5 ml以下になったことを確認する。
    【注1】スイングローターの使用を推奨します。固定アングルローターを用いる場合は、メンブレンパネルが上を向くようバケットに設置してください。
    【注2】AAVベクター溶液が1.5 ml以下になっていない場合は、カップ内に残ったAAVベクター溶液をピペッティングで均一にし、さらに遠心操作を実施してください。
  10. 9.の操作をさらに2回繰り返し、最終的に任意の容量まで濃縮する。
  11. ろ液を除去後、ボルテックスで30秒間、もしくはピペッティングで十分に懸濁し、Amicon Ultra-15, 100 kDaカップ内のAAVベクター溶液をチューブに移す。
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