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Protocols

NucleoBond® RNA Soil Mini

土壌からのRNA精製プロトコール

NucleoBond RNA Soil Mini(製品コード 740142.10/.50)
試薬の調製Buffer E1に沈殿がないことを確認する。もし沈殿がある場合には、30~40℃で保温して沈殿を溶解させる。
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(容量比25:24:1)溶液を室温に戻し、良く混合しておく。
Buffer E5*1が添付の英文説明書に従って調製されていることを確認する。
1.サンプルの準備
NucleoSpin Bead Tube Type Aの1 mlの目盛り線まで、土壌サンプルを加える。通常、サンプル量は250~500 mgとなる。
2.溶解バッファーの添加
NucleoSpin Bead Tube Type Aに800 μlのBuffer E1を加える。
(オプション:さらにBuffer OPT 100 μlを加える。Buffer OPTの添加により無機質の多い土壌ではRNA回収量の増加が期待できるが、有機物の多い土壌では阻害物の混入が多くなる)。
さらに100 μlのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール溶液(添加前によく混合しておく)を加えて、2秒間vortexで混合する。
3.サンプルの溶解
Bead TubeをVortex mixer上のMN Bead Tube Holderにセットし、室温で5分間最高速度で振盪する*2
4.ライセートの清澄化
最高速で(20,000×gが最適)、2分間遠心する。
上清を新しい1.5 mlチューブ(各自で用意)に移す。 抽出液のおおよその液量を計測する。
5.Bufferの添加
抽出液の容量に対して、1/8の液量のBuffer E2を加える。Vortexで5秒間混合する。
室温で2分間静置後、最高速度で(20,000×gが最適)、2分間遠心する。
6.カラムの平衡化
NucleoBond RNA Mini Columnを、Buffer EQU 1.5 mlで平衡化する。
液を自然落下させてカラムを空にする。
7.カラムへの吸着
5.の上清をカラムに入れる。
液を自然落下させてカラムを空にする。このろ液にはフェノール、クロロホルムが含まれるので、適切に処理する。
8.フィルターの洗浄
1回目の洗浄
Buffer E3 250 μlでカラムを洗浄する。
9.カラムの洗浄
2回目の洗浄
Buffer E4 2 mlでカラムを洗浄する。
10.RNAの溶出
Buffer ERNA 1 mlでRNAを溶出する。
溶出液を2 ml遠心チューブ(各自で用意)に集める*3
11.核酸の沈殿
イソプロパノール 700 μl(各自で用意)を加えて、vortexで5秒間混合する。
12.核酸の結合
11.の溶液600 μlをNucleoSpin RNA Column(青色リング)に加え、11,000×g、15秒間遠心する。ろ液を捨て、カラムを元のチューブに戻す。このステップを11の溶液がなくなるまで繰り返す。
13.スピンカラムの洗浄
Buffer E5 500 μlをNucleoSpin RNA Columnの中央に加える。 11,000×g、15秒間遠心する。 ろ液を捨て、カラムを元のチューブに戻す。このステップをもう1度繰り返す。
14.スピンカラムの乾燥
NucleoSpin RNA Columnを11,000×g、1分間遠心する。 ろ液を捨て、カラムを新たな1.5 mlチューブ(各自で用意)に戻す。
15.核酸の溶出
NucleoSpin RNA ColumnにRNase-free H2O 50~100μl を加え、11,000×g、1分間遠心してRNAを溶出させる。
*1
Buffer E5の調製法
Buffer E5(Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール 24 mlを添加する。

*2
自動破砕機を用いてサンプルを破砕してもよい。この場合、破砕条件は使用する機器に合わせて変更する。詳細は英文説明書を参照する。

*3
DNA Set for NucleoBond RNA Soil Miniを使用することでDNAも別途溶出できる。その場合、カラムを別の1.5 mlのチューブ(各自で用意)に移し、Buffer EDNA 1 mlで溶出させる。その後、精製用カラムNucleoSpin DNA Columnを使用してRNAと同様に精製する。
<注意>
使用前には、詳細なプロトコールは必ず添付の英文説明書で確認すること。
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