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Protocols

PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix

1st strand cDNA合成反応

PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix(製品コード 6215A)
  1. 下記に示す反応液を氷上にて調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量
    5×PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix4 μl
    Random 6 mers(50 μM)≦2 μl*1*2
    鋳型RNA total RNA:≦5 μg
    polyA RNA:≦1 μg
    RNase Free dH2OX μl
    20 μl
  2. 穏やかに撹拌し、以下の条件で反応を行う。
    30℃ 10分(Random 6 mers 使用時のみ)
    42℃ 10~20分*3
  3. 95℃、5分または70℃、15分で酵素を失活させた後、氷上で冷却する。*4
  4. *1 2 kb未満のcDNAを合成する場合は1~2 μl、2 kb以上のcDNAを合成する場合は0.4~1 μlのRandom 6 mersを反応液に添加することをお勧めします。Random 6 mers添加時には、反応の最初に30℃ 10分のプレヒートのステップを加えてください。
    *2 Gene Specific Primerも使用可能です。その場合、最終濃度0.1 μMとなるように反応液に添加してください。
    *3 PrimeScript IV RTaseは高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃を推奨します。複雑な高次構造を持つRNAからcDNAを合成する場合、特に逆転写プライマーにGene Specific Primerを使用する場合に、逆転写反応温度を45~55℃にすることで改善が見られることがあります。
    *4 長鎖cDNAを増幅する場合、cDNAへのダメージを避けるため70℃ 15分の失活操作を行ってください。
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