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腸管出血性大腸菌用 Primer Set

毒素原性大腸菌エンテロトキシン遺伝子および腸管出血性大腸菌ベロ毒素遺伝子の検出

毒素原性大腸菌のLT、STh、STpの各遺伝子陽性株を用いた実験例および、腸管出血性大腸菌の各ベロ毒素(VT1、VT2、VT2vha、VT2vhb、およびVT2vp1)遺伝子陽性株を用いた実験例を示す。

■ 反応液組成
専用10×PCR Buffer*1 5 μl
dNTP Mixture(各2.5 mM)*2 4 μl
Primer-1 0.5 μl
Primer-2 0.5 μl
Template DNA*3 5 μl
TaKaRa Taq(5 U/μl)*4 0.25 μl
滅菌水 34.75 μl
Total 50 μl

反応液は氷冷下で調製する。

*1 特殊細菌検出用Primer Set(製品コード S001~S028)に添付している。
*2 TaKaRa Taq(製品コード R001A)に添付している。
*3 精製DNAまたは熱抽出サンプルを使用。なお、熱抽出サンプルは、菌体をLB培地中で37℃、一晩培養した培養液10 μlにTE Buffer(10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.0)または滅菌水90 μl加え、95℃、5分間加熱後、卓上遠心機で菌体の残渣を除いた上清液を用いる。
*4 TaKaRa Taq(製品コード R001A)のほか、TaKaRa Taq Hot Start Version(製品コード R007A)も使用できる。S004は、TaKaRa Taq Hot Start Version(製品コード 007A)の使用を推奨。

S004は、プライマーダイマ−を形成しやすい傾向があります。本製品を用いた検出には、ホットスタート用酵素であるTaKaRa Taq Hot Start Version(製品コード R007A)の使用をお勧めします。ホットスタートタイプではないTaKaRa Taq(製品コード R001A)を用いる場合には、反応液を氷冷下で調製し、サーマルサイクラーの温度が94℃に上がってから反応チューブをセットすることでプライマーダイマ−形成が抑えられます。
■ PCR条件
熱変性94℃、1 min35 cycles
アニーリング55℃、1 min
伸長72℃、1 min

72℃、10 min1 cycle
■ 結果

図1 毒素原性大腸菌エンテロトキシン遺伝子の検出
3%アガロースゲル(エチジウムブロマイド0.5 μg/Lを含む)による電気泳動の結果

Lane M: φX174-Hinc II digest
1、2: 毒素原性大腸菌LT遺伝子陽性株
3、4:    〃   LTおよびSTp遺伝子陽性株
5:    〃   STp遺伝子陽性株
6~8:    〃   STh遺伝子陽性株

図2 腸管出血性大腸菌ベロ毒素遺伝子の検出
3%アガロースゲル(エチジウムブロマイド0.5 μg/Lを含む)による電気泳動の結果

Lane M: φX174-Hinc II digest
1: 腸管出血性大腸菌VT1遺伝子陽性株
2:     〃    VT2遺伝子陽性株
3:     〃    VT1およびVT2遺伝子陽性株
4:     〃    VT1およびVT2vha遺伝子陽性株
5:     〃    VT2vhb遺伝子陽性株
6:     〃    VT2vp1遺伝子陽性株
7: 毒素原性大腸菌LT遺伝子陽性株
8:    〃   STh遺伝子陽性株
9:    〃   STp遺伝子陽性株
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