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TaKaRa DEXPAT™

10年前の切片からのβ-globin、K-ras12、p53(exon 5、exon 6)の増幅

TaKaRa DEXPATと高感度PCR増幅用TaKaRa Ex Taqとの組合せで、より確実なPCR増幅が可能である。以下にTaKaRa Ex Taqを用いた例を示す。
10年前に作製された大腸癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片(10 μm、2枚)からDEXPATで抽出したDNAを用いてPCRを行った。
1.β-globin遺伝子(110、262、400 bp)の増幅
反応液組成
genome DNA(DEXPAT抽出液)5 μl
10×Ex Taq Buffer5 μl
dNTP Mixture5 μl
(250 μM each)
Primer #1(20 pmol/μl)0.5 μl
(10 pmol)
Primer #2(20 pmol/μl)0.5 μl
(10 pmol)
TaKaRa Ex Taq0.25 μl
(1.25 U/50 μl)
滅菌精製水up to 50μl
核酸抽出後の電気泳動
PCR条件

94℃、30 sec
54℃、60 sec
72℃、60 sec

  35 cycles

 ↓
72℃、5 min
3% Agarose gel

Lane M:pHY Marker (100 ng)
Lane 1~3:従来抽出法
Lane 4~6:DEXPAT抽出法

2.K-ras 12遺伝子(107 bp)の増幅
反応液組成
genome DNA(DEXPAT抽出液)5 μl
10×Ex Taq Buffer5 μl
dNTP Mixture5 μl
(250 μM each)
Primer #1(20 pmol/μl)0.5 μl
(10 pmol)
Primer #2(20 pmol/μl)0.5 μl
(10 pmol)
TaKaRa Ex Taq0.25 μl
(1.25 U/50 μl)
滅菌精製水up to 50μl

PCR条件

94℃、30 sec
54℃、60 sec
72℃、60 sec

  35 cycles

 ↓
72℃、5 min

3% Agarose gel
Lane M:pHY Marker (100 ng)
Lane 1:従来抽出法
Lane 2:DEXPAT抽出法

3.p53 exon 5遺伝子 (273 bp)、exon 6遺伝子 (207 bp) の増幅
反応液組成
genome DNA(DEXPAT抽出液)5μl
10×Ex Taq Buffer5μl
dNTP Mixture5μl
(250 μM each)
Primer #1(20 pmol/μl)0.5μl
(10 pmol)
Primer #2(20 pmol/μl)0.5μl
(10 pmol)
TaKaRa Ex Taq0.25μl
(1.25 U/50μl)
滅菌精製水up to 50μl

PCR条件〈1 st PCR〉

94℃、1 min
60℃、1 min
72℃、2 min

30 cycles

 ↓
72℃、5 min

〈2nd PCR〉
Template :1 st PCR産物1μl
PCR液量  :50μl
DNA Polymerase:TaKaRa Ex Taq

94℃、30 sec
60℃、30 sec
72℃、60 sec

25 cycles

 ↓
72℃、5 min 3% Agarose gel
Lane M:pHY Marker (100 ng)

Lane 1:p53 exon 5遺伝子
Lane 2:p53 exon 6遺伝子

 従来抽出法

Lane 3:p53 exon 5遺伝子
Lane 4:p53 exon 6遺伝子

 DEXPAT抽出法

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