TaKaRa DEXPAT™

TaKaRa DEXPATと高感度PCR増幅用TaKaRa Ex Taqとの組合せで、より確実なPCR増幅が可能である。以下にTaKaRa Ex Taqを用いた例を示す。
大腸癌パラフィン包埋切片を用い、同スライド上にて正常部並びに癌部をDEXPATで抽出後、マイクロサテライト解析法によるアリルの変化を調べた。

1. スライドに固定した大腸癌切片（4.5×1.5 cm）を、HE染色した切片と比較し顕微鏡下で癌部と判断した部分（2.3×0.9 cm）をスライドグラスの裏側よりマジックで囲む。
2. マイクロチューブにDEXPAT 500 μlを取り、ヒートブロックで100℃に温めておく。1 ml用チップでDEXPATを吸い取り、マークした癌部に少量のせチップの先で擦り、切片をスライドよりはがしゲルや切片を残らず回収する（正常部の組織を擦らない限り混ざることはないので、特に正常部をマスクする必要はない）。同様に残りの正常部もスライドよりはがす。
3. 試料の入ったマイクロチューブをヒートブロックで100℃、10分間ボイルし、その後4℃で12,000 rpm 10分間遠心分離を行う。上清を別のチューブに移し、これをPCRテンプレートとする。このときゲルや、境界面にある残渣を吸い取らないようにする。

操作フローチャート

10×Ex Taq Buffer	2.5μl
dNTP Mixture	2.5μl	（250 μM each）
each primer	0.25μl	（final 10 pmol）
Template DNA	2.5μl	（DEXPAT抽出液）
TaKaRa Ex Taq	0.125μl	（0.625 U/25 μl）
dH2O	up to 25μl

【TaKaRa Thermal Cycler MPを使用】
94℃、90 sec
↓
↓
72℃、5 min

下記のマイクロサテライトマーカーを使用し、LOH（Loss of heterozygosity、ヘテロ接合性の消失）が検出された。

図2 部位限定抽出したDNAによるLOH解析
N：正常細胞
T：腫瘍細胞