Anti-Bovine Osteocalcin

抗オステオカルシン抗体を用いたラット脛骨の免疫組織染色

各種抗OC抗体を用いて、ラット脛骨の免疫組織染色した例を以下に示す。

【方法-組織切片の調製】
材  料 ラットの脛骨
操作手順 1) PLP固定
2) 10% EDTAによる脱灰
4℃、1週間
3) アセトン
4℃、一晩
4) アセトン
室温30分、4回
5) メチル安息香酸
室温30分、2回
6) キシレン
室温30分、2回
7) パラフィン
60℃、30分、4回
8) パラフィン包埋
9) 薄切

*:ステップ3)~9)はAMeX変法(新鮮凍結切片に準じた抗原性の保持が可能)による。

【方法-免疫組織染色】
一次抗体 OC4-30 10000倍希釈(0.2 μg/ml)
OCG3 5000倍希釈(0.4 μg/ml)
GluOC4-5 10000倍希釈(0.2 μg/ml)
検出方法 sABCシステム(DAKO社)
操作手順 1)脱パラフィン
2)非特異的タンパク質のブロッキング
3)一次抗体
4℃、一晩
4)ビオチン標識二次抗体
室温30分
5)内因性ペルオキシダーゼのブロッキング
6)Strept ABComplex
室温30分
7)DAB反応
8)対比染色(メチルグリーン)
9)脱水・透徹・封入


【結果】

評価した3種の抗OCモノクローナル抗体は、ラット由来のOCとも交差反応し、ラットの組織でも使用できることが確認できた。Gla型OCを認識するOC4-30抗体は、一部の骨芽細胞や骨細胞とも反応したが、主に骨基質に強く反応した(図1のA-D)。
Gla型とGlu型の両方のOCを認識するOCG3抗体は、骨基質と共に骨芽細胞や骨細胞に反応した(図1のE-H)。
一方、Gla化される前段階のOCの21位、24位のGlu(E)残基を認識するGluOC4-5抗体は、骨基質に反応せず、ある時期(生後15~17日)の骨芽細胞に強く反応した。


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図1:皮質骨と海綿骨の免疫組織染色
  OC4-30 OCG-3 OC4-5
皮質骨
(下段は上段の
強拡大図)
海綿骨
(下段は上段の
強拡大図)
【図中の略語】
cb:cortical bone
tb:trabecular bone
h:hematopoetic cells
peri:periosteum

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