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Anti-Human Osteocalcin

抗オステオカルシン抗体を用いたラット脛骨の免疫組織染色

各種抗OC抗体を用いて、ラット脛骨の免疫組織染色した例を以下に示す。

【方法-組織切片の調製】

材  料

ラットの脛骨

操作手順

1)

PLP固定

2)

10% EDTAによる脱灰
4℃、1週間

3)

アセトン
4℃、一晩

4)

アセトン
室温30分、4回

5)

メチル安息香酸
室温30分、2回

6)

キシレン
室温30分、2回

7)

パラフィン
60℃、30分、4回

8)

パラフィン包埋

9)

薄切


*:ステップ3)~9)はAMeX変法(新鮮凍結切片に準じた抗原性の保持が可能)による。

【方法-免疫組織染色】

一次抗体

OC4-30

10000倍希釈(0.2 μg/ml)

OCG3

5000倍希釈(0.4 μg/ml)

GluOC4-5

10000倍希釈(0.2 μg/ml)

検出方法

sABCシステム(DAKO社)

操作手順

1)脱パラフィン

2)非特異的タンパク質のブロッキング

3)一次抗体
4℃、一晩

4)ビオチン標識二次抗体
室温30分

5)内因性ペルオキシダーゼのブロッキング

6)Strept ABComplex
室温30分

7)DAB反応

8)対比染色(メチルグリーン)

9)脱水・透徹・封入



【結果】

評価した3種の抗OCモノクローナル抗体は、ラット由来のOCとも交差反応し、ラットの組織でも使用できることが確認できた。Gla型OCを認識するOC4-30抗体は、一部の骨芽細胞や骨細胞とも反応したが、主に骨基質に強く反応した(図1のA-D)。
Gla型とGlu型の両方のOCを認識するOCG3抗体は、骨基質と共に骨芽細胞や骨細胞に反応した(図1のE-H)。
一方、Gla化される前段階のOCの21位、24位のGlu(E)残基を認識するGluOC4-5抗体は、骨基質に反応せず、ある時期(生後15~17日)の骨芽細胞に強く反応した。



図1:皮質骨と海綿骨の免疫組織染色

 

OC4-30 OCG-3 OC4-5
皮質骨

(下段は上段の
強拡大図)

海綿骨

(下段は上段の
強拡大図)

【図中の略語】
cb:cortical bone
tb:trabecular bone
h:hematopoetic cells
peri:periosteum

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