この画面を閉じる

Application

in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

RNA合成量の比較

キットに含まれるControl Template (linear plasmid ; 約2 kbのtranscript RNAが合成される) を鋳型とし、20 μl反応系および100 μl反応系でそれぞれどのくらいのtranscript RNAが合成されるかを比較した。

【方法】

製品説明書のプロトコールに従い、反応液を調製した。Templateは、20 μl反応系、100 μl反応系とも20 ng、200 ng、および1 μgを使用した。 反応温度は42℃、反応時間は2時間とした。in vitro transcription反応終了後、 RNase free DNase I (5 U/μl) を20 μl反応系の場合は2 μl、100 μl反応系の場合は10 μ添加し、37℃で 30分反応を行って鋳型DNAを除去した。 その後、反応液各0.2μl分を電気泳動で確認した。

【結果】

電気泳動結果
1%アガロースゲル電気泳動

1. 20 μl volume template 20 ng
2. 20 μl volume template 200 ng
3. 20 μl volume template 1 μg
4. 100 μl volume template 20 ng
5. 100 μl volume template 200 ng
6. 100 μl volume template 1 μg
M. pHY Marker

反応液をMEGAclear (Ambion) を用いて精製し、得られたtranscript RNA溶液の濃度をOD260を測定して算出した (ベックマン DU640 スペクトロフォトメーター使用)。さらに精製溶液の液量から合成されたtranscript RNAの量を計算した。
volumetemplateConc. (ng/μl)volume (μl)transcript RNA (μg)
20 μl20 ng161.09449114.7
200 ng286.29969126.1
1 μg537.82089148.9
100 μl20 ng155.23119114.1
200 ng747.04439067.2
1 μg1322.916690119.1
この画面を閉じる