in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

キットに含まれるControl Template (linear plasmid ； 約2 kbのtranscript RNAが合成される) を鋳型とし、20 μl反応系および100 μl反応系でそれぞれどのくらいのtranscript RNAが合成されるかを比較した。

【方法】

製品説明書のプロトコールに従い、反応液を調製した。Templateは、20 μl反応系、100 μl反応系とも20 ng、200 ng、および1 μgを使用した。　反応温度は42℃、反応時間は2時間とした。in vitro transcription反応終了後、 RNase free DNase I (5 U/μl) を20 μl反応系の場合は2 μl、100 μl反応系の場合は10 μ添加し、37℃で 30分反応を行って鋳型DNAを除去した。　その後、反応液各0.2μl分を電気泳動で確認した。

【結果】

1%アガロースゲル電気泳動

1. 20 μl volume template 20 ng 2. 20 μl volume template 200 ng 3. 20 μl volume template 1 μg 4. 100 μl volume template 20 ng 5. 100 μl volume template 200 ng 6. 100 μl volume template 1 μg M. pHY Marker

反応液をMEGAclear (Ambion) を用いて精製し、得られたtranscript RNA溶液の濃度をOD₂₆₀を測定して算出した (ベックマン DU640 スペクトロフォトメーター使用)。さらに精製溶液の液量から合成されたtranscript RNAの量を計算した。