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Application

in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

transcript RNAの鎖長の検討

本キットでin vitro transcription可能な鎖長の検討を行った。
T7プロモーター配列を5' 部分に付加したλDNA増幅用プライマー (T7 lambda 1)と、アンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、2 kb、4 kb、6 kb、8 kb、10 kb、12 kb、15 kbの増幅フラグメントを作製して精製し、OD260測定後、これらを鋳型としてin vitro transcription反応を行った。
アガロースゲル電気泳動
鋳型DNAの確認
1. 2 kbp
2. 4 kbp
3. 6 kbp
4. 8 kbp
5. 10 kbp
6. 12 kbp
7. 15 kbp
M λ-Hind III digest

【方法】

Template使用量は、50 ng (2 kbp)、100 ng (4、6、8 kbp)、200 ng (10、12 kbp) および380 ng (15 kbp) とした。 反応系は20 μlとし、 42℃で2 時間反応を行った。 反応終了後、反応液1 μlとRNAサンプルバッファー*19 μlを混合し、65℃、15分間の熱処理を行ったもの、および行わなかったもの、それぞれ2 μlを電気泳動で確認した。
  (* RNAサンプルバッファー: 64%ホルムアミド、26 mM MOPS pH7.2、6.45 mM酢酸ナトリウム、0.6 mM EDTA)

【結果】

熱処理なし
熱処理なし
65℃、15分熱処理後泳動
65℃、15分熱処理後泳動

 使用した鋳型DNA
1. 2 kbp
2. 4 kbp
3. 6 kbp
4. 8 kbp
5. 10 kbp
6. 12 kbp
7. 15 kbp
M λ-Hind III digest

1%アガロースゲル電気泳動

鋳型として2~15 kbpのDNAを使用した場合、それぞれ対応するtranscrip RNAが得られることが確認された。
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