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Adenovirus Dual Expression Kit (CAG/EF1α)

付録4. 組換えアデノウイルスの拡大調製

以下は、最適な条件で、効率よく組換えウイルスを拡大調製するための方法です。
さらに組換えウイルスを増やしたいという場合は、このプロトコールに従って拡大調製を行って下さい。
効率よく組換えウイルスを増やすためには、そのウイルスの力価が必要です。ウイルスの力価がわからない場合には、まず「プロトコール D. 力価測定」に従い、種ウイルスの力価を測定する必要があります。

  1. コラーゲンコート75 cm2フラスコに70~100% コンルフエントまで培養した293細胞を用意する。
    * ここでは、75 cm2フラスコスケールでの調製を示します。さらに量が必要な場合には、スケールアップして下さい。
  2. 5%FCS-DMEMで、組換えウイルス液を希釈し0.5~1.0×108 PFU/mlのウイルス液を調製する。
  3. フラスコから培地を除いた後、2.のウイルス液 2 mlを静かに加える。
    * アデノウイルスを293細胞に感染、増殖させるとき、MOI(重複感染度; Multiplicity of infection)=10~20(PFU/cell)で感染を行うと効率よくウイルスを増殖させることができます。高い力価のウイルス液を得ようとして、293細胞に濃いウイルス液を感染させると、細胞が死滅してしまい、かえって力価が低下してしまうことがあります。
  4. フラスコをシーソーのように数回、ゆっくりと振とうさせ、ウイルス液をすべての細胞にいきわたらせ感染を行う。この操作を15~20分ごとに3~4回行う。この間、細胞はCO2インキュベーター(37℃、5% CO2)においておく。
  5. 1時間の感染後、5% FCS-DMEM 13 mlを加える。
  6. 3~4日後、完全に細胞が変性したら、培地ごと細胞を無菌的に滅菌チューブに移し、凍結融解または密閉型ソニケーターで破砕して、ウイルスを遊離させる。
  7. 3000 rpm、10分、4℃で遠心し上清を回収する。
  8. シーリングキャップ付マイクロチューブに、使用目的にあわせて必要量ずつ分注し、ドライアイスで急凍して‐80℃で保存する。
  9. 分注したチューブの1本を融解し、力価を測定「プロトコールD.」したのち実験に用いる。
    * 「プロトコールC.」と同様、「同、B-2.」の方法で構造確認、および RCAチェックを行った後に実験に用いることをお勧めします。
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