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実験例-1 変異導入効率の確認

【方法】

pUC118DNA 10 pgを鋳型に、「プライマー設計について」で例示した各変異導入(置換、欠失、挿入)用プライマーとPrimeSTAR Maxを用いてPCR(50 μl)を行った。その2 μlをE. coli JM109コンピテントセル(3×108 cfu/μg pUC118)100 μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後SOC培地1 mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100 μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X-gal)上で培養し、白コロニー(変異体)と青コロニー(バックグラウンド)をカウントした。

【結果】

表 変異導入効率
変異のタイプ  白コロニー   青コロニー   変異導入効率 
置換(3塩基) 1,948 6 99.69%
欠失(3塩基) 2,024 1 99.95%
挿入(6塩基) 1,280 2 99.84%

※ 6塩基挿入に用いたプライマーは、キットコンポーネントのControl primer FとControl primer Rに相当する。

表に示すようにpUC118 DNA 10 pgを鋳型にした場合、3種類の変異導入体(置換、欠失、挿入)が99%以上の非常に高い確率で取得できることを確認した。
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