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Plant DNA Isolation Reagent

実験例7:TaKaRa Ex Taq® HS、PrimeSTAR® GXL、MightyAmp™によるPCR増幅の比較

【推奨PCR酵素】
  • 反応性を重視する増幅にはTaKaRa Ex Taq Hot Start Version(製品コード RR006A/B)、MightyAmp DNA Polymerase(製品コード R070A/B)を推奨している。TaKaRa Ex Taq HSは核酸量が多いサンプルでも良好に働く。植物由来のPCR阻害物質を多く含むサンプルの場合、MightyAmpを用いることで反応性がさらに向上する。
  • 正確性を求める増幅には、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(製品コード R050A/B)を推奨している。High Fidelity PCR酵素の多くは核酸量が多いサンプルからの増幅が不得意であるが、PrimeSTAR GXLは核酸量の多いサンプルにも幅広く対応でき、またPCR阻害物質にも比較的強い特性を有している。
  • 1. TaKaRa Ex Taq HS、PrimeSTAR GXLによるPCR増幅
    【方法】

    10~20 mgの植物組織(シロイヌナズナの幼葉、トマトの幼葉、あるいはホウレンソウの成葉)から抽出したゲノムDNA溶液を鋳型として、それぞれの酵素の推奨条件でPCRを実施し、電気泳動により増幅バンドを確認した。

    Template:各植物組織から抽出したゲノムDNAの原液または希釈液2 μlを使用
    PCR酵素TaKaRa Ex Taq Hot Start Version、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase
    Total volume:25 μl

    Target遺伝子と増幅サイズ
    シロイヌナズナMERI5B遺伝子(約1.0 kb)
    トマトXET遺伝子(約 0.6 kb)
    ホウレンソウcoxI遺伝子(約0.5 kb)

    TaKaRa Ex Taq HSのPCR条件
    シロイヌナズナ、ホウレンソウトマト
    98℃10 sec.
    30 cycle
    98℃10 sec.
    30 cycle
    60℃30 sec.55℃30 sec.
    72℃1 min./kb72℃1 min./kb

    PrimeSTAR GXLのPCR条件
    シロイヌナズナ、ホウレンソウトマト
    98℃10 sec.
    30 cycle
    98℃10 sec.
    30 cycle
    60℃15 sec.55℃15 sec.
    72℃1 min./kb72℃1 min./kb


    【結果】

    1-1.TaKaRa Ex Taq HS



    1-2.PrimeSTAR GXL



    それぞれPCR反応液4μlをアプライ、1 % Agarose L03「TAKARA」
    1:ゲノムDNA溶液原液2:ゲノムDNA溶液2倍希釈液3:ゲノムDNA溶液5倍希釈液
    4:ゲノムDNA溶液10倍希釈液5:ゲノムDNA溶液20倍希釈液6:ゲノムDNA溶液40倍希釈液
    M:250bp DNA Ladder(Dye Plus)




    図7-1.抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCR増幅
    2. MightyAmpによる反応性の改善例
    【方法】

    100 mgの植物組織(ホウレンソウの成葉、あるいはトマトの幼葉)から抽出したゲノムDNA溶液を鋳型として、それぞれの酵素の推奨条件でPCRを実施し、電気泳動により増幅バンドを確認した。

    Template:各植物組織から抽出したゲノムDNAの原液または希釈液2 μlを使用
    PCR酵素TaKaRa Ex Taq Hot Start Version、MightyAmp DNA Polymerase
    Total volume:25 μl

    Target遺伝子と増幅サイズ
    ホウレンソウcoxI遺伝子(約0.5 kb)
    トマトXET遺伝子(約 0.6 kb)

    TaKaRa Ex Taq HSのPCR条件
    ホウレンソウトマト
    98℃10 sec.
    30 cycle
    98℃10 sec.
    30 cycle
    60℃30 sec.55℃30 sec.
    72℃1 min./kb72℃1 min./kb

    MightyAmpのPCR条件
    ホウレンソウトマト
    98℃2 min.98℃2 min.
    98℃10 sec.
    30 cycle
    98℃10 sec.
    30 cycle
    60℃15 sec.55℃15 sec.
    68℃1 min./kb68℃1 min./kb


    【結果】

    1-1.ホウレンソウ

    TaKaRa Ex Taq HSでも良好な増幅が見られたが、MightyAmpを用いることでさらに増幅量がアップした。


    1-2.トマト

    トマト幼葉由来のサンプルは比較的多くのPCR阻害物質を含んでいるため、PCR増幅が難しい傾向が見られる。TaKaRa Ex Taq HSでは40倍希釈液で初めて増幅が確認できたが、MightyAmpを用いると2倍希釈液でも良好な反応を示した。


    それぞれPCR反応液4μlをアプライ、1 % Agarose L03「TAKARA」
    1:ゲノムDNA溶液原液2:ゲノムDNA溶液2倍希釈液3:ゲノムDNA溶液5倍希釈液
    4:ゲノムDNA溶液10倍希釈液5:ゲノムDNA溶液20倍希釈液6:ゲノムDNA溶液40倍希釈液
    M:250bp DNA Ladder(Dye Plus)




    図7-2.抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCR増幅
    3. PrimeSTAR GXLの高速プロトコールによる反応性の改善例
    【方法】

    100 mgのトマトの幼葉から抽出したゲノムDNA溶液を鋳型として、PrimeSTAR GXLの標準プロトコールおよび高速プロトコール(2倍量の酵素を使用)でPCRを実施し、電気泳動により増幅バンドを確認した。

    Template:トマトの幼葉から抽出したゲノムDNAの原液または希釈液2 μlを使用
    PCR酵素:PrimeSTAR GXL DNA Polymerase
    Total volume:25 μl

    Target遺伝子と増幅サイズ
    トマトXET遺伝子(約 0.6 kb)

    PCR条件
    GXL標準プロトコールGXL高速プロトコール
    98℃10 sec.
    30 cycle
    98℃10 sec.
    30 cycle
    55℃15 sec.55℃15 sec.
    68℃1 min./kb68℃10 sec./kb


    【結果】

    植物由来の阻害物質を多く含むサンプルには、PrimeSTAR GXLの高速PCRプロトコールを推奨する。また、酵素量を2倍量かつ伸長時間を1 min/ kbで反応を行うとさらに反応性が改善する場合もある。

    それぞれPCR反応液4μlをアプライ、1 % Agarose L03「TAKARA」
    1:ゲノムDNA溶液原液2:ゲノムDNA溶液2倍希釈液3:ゲノムDNA溶液5倍希釈液
    4:ゲノムDNA溶液10倍希釈液5:ゲノムDNA溶液20倍希釈液6:ゲノムDNA溶液40倍希釈液
    M:250bp DNA Ladder(Dye Plus)




    図7-3.抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCR増幅
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