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Tough Decoy miRNA-Blocking Expression Vectorによる持続的なmicroRNA阻害効果

Tough Decoy miRNA-Blocking Expression Vectorは、microRNAと相補的な配列を持ち、特異的にその活性を阻害するTough Decoy RNA(TuD RNA)(図1)を発現するベクターです。

発現したTough Decoy RNAは独自のstem-loop-stem構造をとり、核から細胞質に安定に輸送された後、RISC内のmicroRNAに結合し、その活性を阻害します(図2)。

図1. Tough Decoy RNAの構造模式図

図2. Tough Decoy RNAが標的となるmiRNAに対して特異的に活性を阻害
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【実験例:Tough Decoy RNAによるmiRNA阻害効果の持続】
本実験は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らの研究グループで行われ、伊庭教授のご厚意により研究論文掲載データを転載しました。
※本実験のTuD RNA発現ベクターは「Tough Decoy miRNA-Blocking Expression Vector」とはベクター骨格が異なります。

<方法>

  1. ヒト培養細胞HeLaS3を10% FBSを含むDMEM培地で37℃培養した。
  2. GFP遺伝子の3’UTRにmiR-140-3pと完全相補な配列を持つ遺伝子(GFP-miR140-3p Target)およびネオマイシン耐性遺伝子を持つレトロウイルスベクターでHeLaS3細胞を形質導入し、2週間のG418(1 mg/ml)選択を行った。
  3. GFP-miR140-3p Targetを発現するHeLaS3細胞にmiR140-5p/140-3pおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを感染させ、ハイグロマイシン(0.5 mg/ml)で2週間、導入細胞を選択した。
  4. Tough Decoy RNA発現カセット(TuD-miR140-5pまたはTuD-miR140-3p)を持つレンチウイルスベクターを上記細胞に感染させ、ピューロマイシン(1 μg/ml)で7日間、導入細胞を選択した。
  5. Tough Decoy RNA発現レンチウイルスベクター導入後、8日目から各細胞のGFP発現レベルをFACS Calibur(BD社)で測定した。

<結果>

図3より、GFP-miR140-3p Targetを発現している細胞(―――)と比較して、miR-140-5p/140-3pを発現する細胞ではGFP発現が著しく抑制された(―――)。miR140-3pの相補配列を有するTuD-miR140-3pを導入した細胞では、miRNAによるGFP発現阻害効果が抑制され、GFPの発現が回復した(- - - - -)。一方、ネガティブコントロールであるTuD-miR140-5pを導入した細胞では、GFP発現は抑制されたままであった(- - - - -)。これらの効果は、約30日間持続することが確認された。

図3. TuD RNAによるmiRNAの阻害効果
【参考文献】
Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells.
Takeshi Haraguchi, Yuka Ozaki, and Hideo Iba. Nucleic Acids Res. vol 37. No.6. e43 (2009).
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