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K562細胞を用いたRNPでのゲノム編集

【実験の流れ】
【実験の流れ】 ・K562細胞
(ターゲットはCD81遺伝子)
【方法】
試薬の準備

Cas9タンパク質:Guide-it Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)(製品コード 632641)
sgRNA:Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)によりCD81遺伝子に対するsgRNAを調製
遺伝子導入試薬:TransIT-X2(製品コード MIR6003)またはA社遺伝子導入製品。

1日目:細胞の準備

K562細胞を3.5×105 cells/mlに調製し、0.5 mlずつ24 well plateへ播種した。

2日目:ゲノム編集
TransIT-X2によるRNPでのゲノム編集 (24 well plate)>
  1. Opti-MEM I Reduced Serum Media 50 μlにCas9タンパク質とsgRNAを加えてピペッティングした後、37℃で5分間インキュベート
  2. TransIT-X2を1 μl添加してピペッティング
  3. 室温で15~30分間インキュベート
  4. 細胞へ添加
<A社製品によるRNPでのゲノム編集>
製品protocolに準じて実施
4日目:細胞の継代

9日目:Flow cytometryによるノックアウト効率(ゲノム編集効率)の解析

K562細胞のCD81陰性細胞率の割合をノックアウト効率としてFlow cytometryを用いて解析した。

【結果】

K562細胞のCD81陰性細胞の割合を評価した。TransIT-X2はCの条件で10%を超え、A社試薬を用いたものと比較して高いノックアウト効率を示した。NTは処理の細胞を示す(図1)。

【結果】
図1.K562細胞でのA社製品とのノックアウト効率の比較
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