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SMART-Seq® Stranded Kit

セルソーターを用いたシングルセルRNA-Seq実験を成功させるための5つのTips

高品質のシングルセルRNA-Seqデータを得るには、シングル且つ生細胞を捕獲し、ライブラリー調製前にRNAの分解を防ぐため、迅速かつ慎重に作業をすることが重要です。ソーティングの成功の為には、ソーティング技術の慎重な計画と最適化が必要です。ここに、一般的な問題を解決するために役立つヒントを示します。これらは、私たちのライブラリー調製キットの上流において、一般的な問題を回避し、サンプル品質を最高にする細胞収集に関する推奨事項を含むヒントです。

1.セルソーターを詰まらせない
目詰まりしたフローサイトメーターほど悪いものはありません!ソーティングが遅くなり、サンプルが劣化する可能性があります。したがって、遠心分離、セルストレーナ、またはその他の方法で細胞破片や細胞塊を除去して、それらがないことを確認する必要があります。細胞生存率を犠牲にすることなくシングセルの数を最大にするために、単離技術を最適化してください。マグネシウムとカルシウムは多くの接着分子に必要なため、ろ過した1×PBS(EDTA、MgおよびCa不含、1~2%BSA添加)またはBD FACS Pre-Sort Buffer(BD社.Cat No 563503)に細胞を懸濁することをお勧めします。また、BD FACS Pre-Sort Bufferは生存率を維持するために血清タンパク質を含んでいます。培地にソーティングされた細胞は生存率が下がることもあり(Kissner 2015)、cDNA合成を阻害することもあります。生きたシングルセルを最大限に取得するために、ソーティング前に生存確認用の染色を行うことを推奨します。

2.細胞をやさしく扱う
セルソーティングは細胞に対して優しくありませんが、ソーティング中の細胞へのダメージや溶解を最小限に抑えるために、できることがいくつかあります。Tips 1のソーティング前のバッファーガイドラインに従うことに加えて、特に脆弱な細胞に対しては、ノズルのサイズを大きくしたり、流速を遅くすることをお勧めします。セルソーターの最適な設定にするため、フローサイトメーターのコア施設または機器メーカーと協力して行ってください。特に低流速で希少細胞のソーティングを行う場合は時間がかかることがあります。したがって、ソーティング前に事前濃縮するか、2段階のソーティングを行うことをお勧めします。

3.ウェルの底にソーティング
これは簡単に思えますが重要な問題です。セルソーターがプレート/チューブのウェルの底に、細胞を含む液滴が落ちるようにセッティングされていることを確認してください。プレートやチューブが適切な位置にない場合、細胞がウェルの側面に集まり、そこで乾燥して、RNAが分解する可能性があります。さらに悪いことに、細胞はウェル内に全く回収されないかもしれません。フローサイトメーターのコア施設または機器メーカーと協力して、ソーターを調整してください。液滴を適切に落とすために、蛍光ビーズ(Zigon et al. 2018)、HRPを用いたレポーター(Rodrigues and Monard 2016)、さらにはリトマス試験紙(Baumgartner et al. 2014)を用いた品質管理方法を開発した研究者もいるので、それらの文献を参考にすることもできます。

4.溶解バッファーにソーティング
細胞のソーティング後、トランスクリプトームはできるだけ早く安定化させる必要があります。したがって、RNaseインヒビターを含む新鮮な冷却された溶解バッファーにソーティングすることをお勧めします。細胞がプレート/チューブに入ったら、100 gで15~30秒間穏やかに遠心します。すぐにcDNA合成に進まない場合は、サンプルをドライアイス上に置いて急速凍結し、-80℃で数週間保存できます。これらのステップによって、ソーティングされた細胞がRNaseインヒビターを含む溶解バッファーに入っていることが確認できます(液滴は時々跳ね返ることがあるため)。幣社のシングルセルRNA-Seqキットにおける推奨事項は下記の表をご参照ください。
表1.各SMART-Seqキット用の推奨コレクションバッファー
キット推奨コレクションバッファー容量/well内容
SMART-Seq v41×Reaction Buffer11.5 μlLysis buffer and RNase inhibitor
SMART-Seq HTCDS Sorting Buffer12.5 μlLysis buffer, RNase inhibitor, and CDS primer
SMART-Seq Stranded1.25×Lysis Buffer Mix8 μlLysis buffer and RNase inhibitor
正確なバッファー組成は各キットのユーザーマニュアルに記載されてます。

5.専門家への相談
セルソーティングは複雑で、各セルソーターは特性が異なります。実験を始める前に、フローサイトメーターのコア施設または機器メーカーにご相談ください。これらの専門家は正しく実験を行うための手助けをしてくれます。

参考文献
Baumgartner, T. et al. “Direct visual confirmation of sort material deposition alignment at the bottom of 96 and 384 well PCR plate wells.” Poster presented at the XXIX Congress of the International Society for Advancement of Cytometry, Ft. Lauderdale, FL, May 2014.

Kissner. How Cell Culture Medium Can Decrease Cell Viability During A Flow Cytometry Cell Sorting Experiment. Expert Cytom. (2015).

Rodrigues, O. R. & Monard, S. A rapid method to verify single-cell deposition setup for cell sorters. Cytom. Part A 89, 594-600 (2016).

Zigon, E. S. et al. A rapid single cell sorting verification method using plate-based image cytometry. Cytom. Part A 93, 1060-1065 (2018).
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