SMART-Seq^® Stranded Kit

SMART-Seq Stranded Kitは、1～1,000個の細胞または10 pg～10 ngのtotal RNAから、方向性情報を持ったイルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリー調製ができるキットである。高い再現性と均一なGene Bodyカバレッジを示し、GCリッチな転写産物も正確に検出できる。 本キットではSMART（Switching Mechanism at 5' End of RNA Template）テクノロジーを用いており、完全長のトランスクリプト情報を取得するため、転写産物のアイソフォーム、融合遺伝子、点変異などの解析が可能である。また本キットでは、ライブラリー調製中に、リボゾーム由来のDNAを除去することができるため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はない。
本キットはランダムプライマーによるcDNA合成を行うため、すべてのトランスクリプトをキャプチャーし、分解の進んだ低品質RNAでも使用可能である。高品質RNAを用いてオリゴdTプライマーによるcDNA合成を行いたい場合はSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingをお勧めする。

また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。

PCR1で付加されたアダプターは、イルミナ社次世代シーケンサーのフローセルへの結合部位（P7、P5）およびIndex（Index 1 [i5]、Index 2 [i7]）配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1は元のRNAのアンチセンスの配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス鎖の配列が得られる。Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はSMART-Seq Stranded Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピング前にトリミングする必要がある。

ヒト脳の total RNA（10 pg～10 ng）から本キットと用いて、RNA-seqライブラリーを作製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
本表のデータは、三連の実験の平均を示し、わずか10 pgのRNA input量の場合でも非常に高い再現性（Pearson/Spearman）を示した。

Panel A：ヒト脳のtotal RNA（50 pg～10 ng）を用いてSMART-Seq Stranded KitおよびSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian（Pico v2）を用いてRNA-seqライブラリーを三連で作製した。取得したデータは250万リード（paired-end）で解析を行った。
Pico v2 KitのインプットRNAの範囲（250 pg～10 ng）では、両キットでほぼ同等の性能を示したが、1 ng以下では、SMART-Seq Stranded Kitのほうがより多くのトランスクリプトを検出した。
Panel B：50 pgの total RNAから各々のキットで作製されたライブラリーを用いて発現解析を行い、再現性を比較した。
SMART-Seq Stranded Kit（Pearson=0.97）は50 pg total RNAにおいてもPico v2（Pearson=0.92）よりも高い再現性を示した。

セルソーティングによって単離されたA375細胞から、SMART-Seq Stranded Kitを用いてライブラリーを作製した。インプットした細胞数は1細胞から1,000細胞で、5～1,000細胞は二連、1細胞は12連で行った。 比較のために1,000細胞から精製したtotal RNAを用いて二連でライブラリーを作製した。
Panel A: 1～1,000細胞から調製したライブラリーの評価
Panel B: Panel Aに示された全てのサンプル間のユークリッド距離を表示した階層的クラスタリング解析。Pearson相関係数は0.85から0.99を示した。シングルセルはCell1～Cell12と表示し、他のインプット量の細胞のレプリケートはa～bと表示している。

Box 1

SMART scTSO Mix
scR-Probes
Control Total RNA (1 μg/μl)

Box 2

scZapR v2
SMART scN6
scRT Buffer
SMARTScribe RT (100 U/μl)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
ZapR Buffer (10X)
Tris Buffer (5 mM)
PCR2 Primers v2
Nuclease-Free Water
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer (2X):
10X Lysis Buffer

Indexing Primer Set:

12回用（製品コード 634442）

Indexing Primer Set HT for Illumina v2-12
3' PCR Primer HT Index 2 (3' 2；12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1～12 (5' 1～12; 12.5 μM)

48回用（製品コード 634443）

Indexing Primer Set HT for Illumina v2- 48
3' PCR Primer HT Index 1～4 (3' 1～4； 12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1～12 (5' 1～12； 12.5 μM)

96回用（製品コード 634444）

Indexing Primer Set HT for Illumina v2-96
3' PCR Primer HT Index 1～8 (3' 1～8； 12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1～12 (5' 1～12； 12.5 μM)

Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set：－20℃

下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
• PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  （Final RNA-Seq Library Amplificationのステップを100μlの反応液でPCRを行うため、100 μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50 μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。）
• フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 0.2 ml tube minicentrifuge
• 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI Cat. No. 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block (Light Labs Cat. No. A-7079)

セルソーティング

• 96-well polycarbonate PCR plates (USA Scientific社 Cat.No . 2796-3330) or 8-tube strips (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0264) inserted into a PCR rack
• BD FACS Pre-Sort Buffer (BD Cat No. 563503)
• Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS without Ca^2＋ and Mg^2＋;) （Sigma-Aldrich 社 Cat. No. D8537)
• Adhesive PCR Plate Foils (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0626) or 8-cap strips (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0784)
• ドライアイス

PCR増幅およびバリデーション

• Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Cat No.5067-4626)
• Qubit dsDNA HS kit (Thermo Fisher Scientific Cat. No. Q32851)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
• Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)

SPRI Bead精製

• Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（5 ml; Beckman Coulter社; 5 ml Code. A63880、60 ml Code. A63881）
• 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device (SMART-Seq Magnetic Separator –PCR Strip :製品コード 635011)
• 80％ Ethanol（用時調製）