微量FFPEサンプルからもRNA-Seqが可能
- ヒト、マウス、ラットの微量（250 pg～）のtotal RNAからRNA-Seq解析が可能
- FFPEやLCM由来の分解を受けたRNAやcell-free RNAを含むすべての品質のRNAから信頼性の高い結果を取得
- シーケンス結果の改良 ― PhiXを添加しなくても高いクラスターpassing filter（％ PF）が得られる
- すべての工程が6時間で完了する迅速プロトコール
- PCRバッファーの改良により、ライブラリー精製の効率がアップ
- 最大96インデックスの設定が可能なイルミナ社NGS装置対応のライブラリー作製
製品説明
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalianは、250 pg～10 ngのヒト、マウス、ラットtotal RNAからイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを効率よく作製するキットである。本キットは、高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNAでも使用することができる。インデックスとアダプターを付加したstrand-specific RNA-Seqライブラリーを、逆転写反応、PCR増幅のステップも含めた一連の操作により作製できる。
従来品に比べてv2キットは、イルミナ社シーケンサーにおけるシーケンスのパフォーマンスを改良する工夫がされており、また、より使いやすいライブラリー精製のワークフローになっている。
total RNA中に含まれるリボソームRNA（rRNA）（および一部ミトコンドリアRNA）は、rRNA特異的プローブを使用した独自技術を採用することにより、効率的に除かれる。その結果、シーケンスコストを下げ、マッピング精度（mapping statistics）を上げることができる。
v2キットで作製されたライブラリーは従来のキットで作製されたライブラリーとは異なる設計になっており、イルミナ社のNGS装置を使用する際、大量のPhiXを添加しなくても高いClusters passing filter（% PF）を得ることができる。その結果、シーケンスの1ランあたり、より生物学的に有意義なリードを得ることができるので、シーケンスコストを下げることができる。v2キットを用いたデータはrRNAやmtRNAにマッピングされるリードが少なく、duplicateの割合も低いため、よりユニークなtranscriptsを識別する傾向がある。さらにv2キットはPCR Bufferの組成を改良したことにより、ライブラリー精製の効率が増大した。
本キットには、12、48、96および192回用の製品があり、96回用および192回用（製品コード 634413、634414）の製品には12種類のReverseプライマーと8種類のForwardプライマーが含まれており、ハイスループット解析用に最大96インデックスが設定できる。
また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。
図1. 実験フローチャート
従来品に比べてv2キットは、イルミナ社シーケンサーにおけるシーケンスのパフォーマンスを改良する工夫がされており、また、より使いやすいライブラリー精製のワークフローになっている。
total RNA中に含まれるリボソームRNA（rRNA）（および一部ミトコンドリアRNA）は、rRNA特異的プローブを使用した独自技術を採用することにより、効率的に除かれる。その結果、シーケンスコストを下げ、マッピング精度（mapping statistics）を上げることができる。
v2キットで作製されたライブラリーは従来のキットで作製されたライブラリーとは異なる設計になっており、イルミナ社のNGS装置を使用する際、大量のPhiXを添加しなくても高いClusters passing filter（% PF）を得ることができる。その結果、シーケンスの1ランあたり、より生物学的に有意義なリードを得ることができるので、シーケンスコストを下げることができる。v2キットを用いたデータはrRNAやmtRNAにマッピングされるリードが少なく、duplicateの割合も低いため、よりユニークなtranscriptsを識別する傾向がある。さらにv2キットはPCR Bufferの組成を改良したことにより、ライブラリー精製の効率が増大した。
本キットには、12、48、96および192回用の製品があり、96回用および192回用（製品コード 634413、634414）の製品には12種類のReverseプライマーと8種類のForwardプライマーが含まれており、ハイスループット解析用に最大96インデックスが設定できる。
また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。
図1. 実験フローチャート
5' PCR Primer HTおよび3' PCR Primer HTにより付加されたアダプターは、イルミナ社シーケンサーのフローセルへの結合部位（P7、P5）およびイルミナ社 TruSeq HT Index（Index 1 [i5]、Index 2 [i7]）の配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる（元のRNAの方向は 5’→3’になる）。
Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はPico v2 SMART Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピングの前にトリミングする必要がある。
従来のキット（Pico v1）と本キット（Pico v2）を用いて作製したライブラリーを、NextSeq 500またはMiniSeqを用いてシーケンスを行った。それぞれのグラフにおいて、青い枠の部分はunfiltered (raw) リードのクラスター密度の分布を示している。一方、緑の枠の部分はfilteringを行ったリードのクラスター密度の分布を示している。
Passing filterのリード数（M：million）と%PFの値をグラフの上に表記した。
イルミナ社の規格では、予想されるPassing filterのリード数は、NextSeqの場合は130 M、MiniSeqの場合は25 Mである。PhiXはPico v2キットでは1％、Pico v1キットでは10％添加している。
Pico v2キットの場合、PhiXにアライメントされたリードの割合はすべてのシーケンスランにおいて、0.5％から1.15％の間である。
上記のグラフの結果により、Pico v2キットで作製されたライブラリーは、Pico v1キットに比べて高い% PFの値が得られた。
1 ngまたは10 ngのヒト肺FFPE組織から抽出したTotal RNAから、従来のキット（Pico v1）および Pico v2キットを用いてライブラリーを調製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
Panel A：1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーの評価
どちらのinput量においてもPico v2を用いた場合、ライブラリーの収量が多く、rRNAやmtRNAにマッピングされるリード数の割合や、Duplicateの割合が低かった。1 ngのinputではPico v2のライブラリーから得られたシーケンスデータでは、Pico v1の場合に比べて数千以上多くのTranscript数が得られ、Pico v2では高い感度での解析が可能になった。
Panel B : 1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性
Pico v2キットを用いた場合、Pico v1キットに比べて1 ngと10 ngのinputのデータにおいて高い再現性が見られた。FPKMの値はlog10 scaleで表示している。
内容
- Package 1:
- SMART TSO Mix v2
- R-Probes v2
- Control Total RNA (1 μg/μl)
- Package 2
- ZapR v2
- SMART Pico Oligos Mix v2
- 5X First-Strand Buffer
- SMARTScribe RT (100 U/μl)
- RNase Inhibitor (40 U/μl)
- 10X ZapR Buffer
- SeqAmp DNA Polymerase
- SeqAmp CB PCR Buffer (2X):
- Tris Buffer (5 mM)
- PCR2 Primers v2
- Nuclease-Free Water
- Indexing Primer Set:
- 12回用（製品コード 634411）
- Indexing Primer Set HT for Illumina v2-12
- 3’ PCR Primer HT Index 2 (3’ 2; 12.5 μM)
- 5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)
- 48回用（製品コード 634412）
- Indexing Primer Set HT for Illumina v2- 48
- 3’ PCR Primer HT Index 1～4 (3’ 1～4 ; 12.5 μM)
- 5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)
- 96回用（製品コード 634413）、192回用（製品コード 634414）
- Indexing Primer Set HT for Illumina v2-96（192回用は2個含まれる。）
- 3’ PCR Primer HT Index 1～8 (3’ 1～8; 12.5 μM)
- 5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)
保存
Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set：－20℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set：－20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
PCR増幅およびバリデーション
SPRI Bead精製
- シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
- 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
- Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
- PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
（Final RNA-seq Library Amplificationのステップを100μlの反応液でPCRを行うため、100μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。） - フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
- 0.2 ml tube minicentrifuge
- 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI社 Code 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block（Light Labs社 Code A-7079）
PCR増幅およびバリデーション
- Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code 5067-4626）
- Qubit dsDNA HS kit（Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851）
- Nuclease-free thin-wall PCR tube（USA Scientific社；0.2 ml Code 1402-4700）
- Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)
SPRI Bead精製
- Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（Beckman Coulter社; 5 ml, Code A63880、60 ml, Code A63881）
- 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）
- 80％ Ethanol（用時調製）
Technical Notes
Improved ease of use and sequencing performance for whole transcriptome analysis of high-quality or degraded samples
Stranded NGS libraries from FFPE samples
RNA-seqを成功させるためのコツ（英語）
ヒト生体液および細胞外小胞からのtotal RNA-seq（英語）
RNA-seqのヒント（英語）
無細胞核酸のシーケンス解析（英語）
Total RNA-seqの概要（英語）
SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 Pico Input Mammalianを用いたRNAバイオマーカー探索（英語）
この製品を見た人は、
こんな製品も見ています
-
SMARTer® Stranded RNA-Seq Kit
方向性の情報をもつNGS用ライブラリー作製が可能 (total RNA量 10～100 ng)
-
SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian
UMI付き、微量FFPEサンプルからもRNA-Seqが可能
-
SMART-Seq® Stranded Kit
シングルセルまたはtotal RNA 10 pgからの方向性情報を持ったtotal RNA-Seq解析
-
次世代シーケンス（NGS）関連試薬選択ガイド RNAシーケンス
-
SMARTer® RNA Unique Dual Index Kit
RNA-Seq用ユニークデュアルインデックスキット
-
SMARTer® Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian
total RNA 100 ng～1 μgからイルミナ社NGS用ライブラリーを迅速に調製
- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
- タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
- タカラバイオ製品に関連するライセンス・パテントについては、ライセンスマークをクリックして内容をご確認ください。
また、他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。 - ウェブサイトに掲載している会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
