本製品は、96ウェルまたは各種プレートで培養した様々な動物細胞（cell line化した接着細胞や浮遊細胞、初代培養細胞、各種幹細胞、iPS細胞など）からRNA抽出操作を行うことなく、簡単な手順で2ステップリアルタイムRT-PCRを行うためのキットである。本キットを使用することで、培養細胞から最短約1.5時間で鋳型サンプルの調製から逆転写反応、遺伝子発現解析までを完了することができる。また、ゲノムDNAの除去が効果的に行えるため、ゲノムDNAの混入が問題になる解析（エキソンジャンクションを挟むプライマーが設計できない場合、低発現遺伝子の発現解析を行う場合など）でも威力を発揮する。SYBR Green I検出用、またはプローブ検出用の2ステップリアルタイムRT-PCR試薬^＊がセットになっているので別途用意する必要が無く、簡便に遺伝子発現解析を行うことができる。

＊本製品に含まれるqPCR試薬は以下と同じものです。足りない場合は別途ご購入ください。
　　3735A/Bの場合：SYBR Fast qPCR Mix（製品コード RR430S/A/B）
　　3736A/Bの場合：Probe qPCR Mix（製品コード RR391A/B）

＜本製品の特長＞

1. 解析時間が大幅に短縮され（最短 約1.5時間）、ハイスループット解析にも最適
   従来品（CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time)、製品コード 3732）と異なり、逆転写反応前に行うDNaseを不活化のための熱処理ステップが不要
   操作の煩雑さが軽減され、ハイスループット解析にもおススメ
2. iPS細胞などの幹細胞から分化した細胞にも使用可能に
   Lysis Bufferの改良により、より多くのcell line化した接着細胞や浮遊細胞、初代培養細胞、各種幹細胞、iPS細胞などで使用が可能
3. ライセートの長期保存が可能
   ライセート調製時にStop Solutionを新規採用したため、ライセートの安定性が向上
   －20℃保存で少なくとも6ヵ月まで安定した反応性を確認
4. リアルタイムPCR試薬は阻害物質に強く、特異性も高い
   SYBR Fast qPCR Mix（製品コード RR430）とProbe qPCR Mix（製品コード RR391）を採用し、PCR阻害物質に対する高い抵抗性を実現。また、GC含量の高いターゲットにも対応

【方法】	iPS細胞から心筋細胞に分化誘導を行い、分化誘導開始5日後、18日後、42日後（それぞれday 5、day 18、day 42と表記する）に細胞数が1×104 cellsになるように回収し、プロトコールに従ってそれぞれライセート50 μlを調製した。 さらにプロトコールに従って逆転写反応、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を実施した。 コントロールとして精製したtotal RNA（1×104 cellsからRNA抽出）を用い、同様に遺伝子発現解析を行った。

【結果】	day 5を1とした場合の発現量の遷移を比較したところ、本製品で調製したライセートからも、高純度に精製されたRNAを用いた場合と同等の遺伝子発現のプロファイル結果が得られた。

【方法】	HeLa細胞、Jurkat細胞、293細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）、およびiPS細胞から誘導した心筋細胞をそれぞれ1×104 cellsになるように回収し、プロトコールに従ってそれぞれライセート50 μlを調製した。さらにプロトコールに従って逆転写反応、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を実施した。 コントロールとして精製したtotal RNA（1×104 cellsからRNA抽出）を用い、同様に遺伝子発現解析を行った。

【結果】	本製品で調製したライセートからも、高純度に精製されたRNAを用いた場合と同等の遺伝子発現のプロファイル結果が得られた。

	製品名	3735A/3736A	3735S/3736S
1．	CellAmp Washing Buffer＊1	2.5 ml×5	2.5 ml
2．	CellAmp Lysis Buffer II＊1	1 ml×5	1 ml
3．	DNase I for Direct RNA Prep＊1	200 μl	40 μl
4．	Stop Solution＊1	250 μl	50 μl
5．	PrimeScript RT Enzyme Mix＊2	200 μl	40 μl
6．	5×CellAmp Buffer II＊2	400 μl	80 μl
7．	RT Primer Mix＊2、3	100 μl	20 μl
8．	RNase Free H2O＊2	1 ml×2	1 ml
9．	SYBR Fast qPCR Mix（2×）（3735A/S）＊4 またはProbe qPCR Mix（2×）（3736A/S）＊4	625 μl×10	625 μl×2
10．	ROX Reference Dye（50×）＊4	250 μl	50 μl
11．	ROX Reference Dye II（50×）＊4	250 μl	50 μl

*1	Cell Lysisのための試薬	3735A/3736A　100回分	3735S/3736S　20回分
*2	RT（逆転写）試薬	3735A/3736A　100回分	3735S/3736S　20回分
*3	Oligo dT Primer、Random 6 mersを含む。
*4	qPCR試薬	3735A/3736A　500回分	3735S/3736S　100回分

－20℃

－20℃

CellAmp Washing Buffer およびCellAmp Lysis Buffer II
融解後は4℃で保存可能。コンタミネーションには十分注意してください。

3735S/A :SYBR Fast qPCR Mix（2×）
4℃保存で6ヵ月安定。必ず遮光し、コンタミネーションには十分注意してください。

• 長期保存の場合は、－20℃で凍結保存してください。いったん融解したSYBR Fast qPCR Mix（2×）は4℃保存し、6ヵ月を目途にご使用ください。
• 使用時には、穏やかな転倒混合により必ず完全に溶解し、均一に混合してからご使用ください。

3736S/A: Probe qPCR Mix（2×）
4℃保存で6ヵ月安定。コンタミネーションには十分注意してください。

• 長期保存の場合は、－20℃で凍結保存してください。いったん融解したProbe qPCR Mix（2×）は4℃保存し、6ヵ月を目途にご使用ください。
• 使用時には、穏やかな転倒混合により必ず完全に溶解し、均一に混合してからご使用ください。

Perfect Real Timeサポートシステムについて
Perfect Real Timeサポートシステムは、インターカレーター法（SYBR Green I検出）によるリアルタイムRT-PCR用に最適化されたプライマーを検索・オンライン注文するためのシステムです。
ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリ、イネ、シロイヌナズナのRefSeq登録遺伝子またはEnsemblPlants登録遺伝子に対して網羅的にリアルタイムRT-PCR用のプライマーを設計しています。
ターゲット遺伝子を検索し、ご希望のプライマーセットを選択すれば簡単にオンラインで注文できます。わずらわしいプライマー設計と反応条件の至適化作業はもう不要です。siRNAの効果の確認、DNAマイクロアレイ解析結果の検証など遺伝子発現定量や遺伝子検出にどうぞお気軽にご利用ください。
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TaKaRa qPCR Probeについて
遺伝子発現解析に最適なプライマー・蛍光標識プローブ合成受託サービスです。対象遺伝子のAccession No.や配列情報、遺伝子名、生物種などの情報を連絡いただき、プライマー・プローブのカスタム設計を承ります。 設計後は、プライマー・プローブの配列情報を確認した上で注文いただけます。

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