FTA®カードや採血ろ紙から直接PCR

MightyAmp™ for Card

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR R072A R072A MightyAmp™ for Card
200回 ¥40,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR R072B(A×4) R072B(A×4) MightyAmp™ for Card
800回 ¥136,500
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

MightyAmp DNA Polymeraseは、特に2 kb程度までの短鎖の増幅において究極の反応性を追求して開発されたPCR 酵素であり、通常のPCR酵素では増幅が困難なPCR阻害物質を多く含むクルードな生体粗抽出液を用いる場合にも、その強力な増幅能により良好な反応性を示す。
本製品では、MightyAmp DNA Polymeraseと専用バッファーを組み合わせることにより、血液、口腔粘膜、植物の葉などの試料を塗布したFTAカード、血液を採集したNucleoCardやろ紙から、DNA抽出、精製等の操作を行うことなく、直接、目的のDNA配列をPCR増幅することができる。
通常、試料を塗布したFTAカードからPCR増幅を行うためには多ステップのDNA精製操作が必要だが、MightyAmp for Cardを用いることで、DNA精製操作を行うことなく短時間に多検体の解析が可能となる。
なお、本酵素は98℃までポリメラーゼ活性を抑制する強力なモノクローナル抗体を用いたホットスタートPCR用酵素である。

内容

(200回用)*1
MightyAmp DNA Polymerase(1.25 U/μl)200 μl
2×MightyAmp Buffer for Card(Mg2+、dNTP plus)*21 ml×5

*1 反応容量50 μlでの回数
*2 Mg2+濃度は4 mM(2×)、dNTP濃度は各800 μM(2×)

保存

-20℃

一般的なPCR反応液組織(Total 50 μl)


使用量最終濃度
2×MightyAmp Buffer for Card 25 μl
Primer 115 pmol0.3 μM
Primer 215 pmol0.3 μM
サンプルをアプライしたFTA Card/ろ紙*1直径1.2~2 mm
MightyAmp DNA Polymerase1 μl1.25 U/50 μl
滅菌水up to 50 μl

*1 サンプル例
  • EDTA血、へパリン血*2 をアプライしたFTAジーンカード、FTAマイクロカード、またはろ紙
  • 植物の葉をホモジネートしてアプライしたFTAプラントセーバーカード
  • 口腔細胞をアプライしたFTAマイクロカード指示薬付き
  • 植物の葉を直接アプライしたFTAプラントセーバーカード
*2クエン酸血を用いると反応性が著しく低下するため、クエン酸血をアプライしたサンプルの使用は推奨しない。

プライマー設計について

  • できるだけOLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights社)などのプライマー設計ソフトを利用して、最適な配列を選択する。
    Tm値(下記の式*で計算)が60℃以上になるように設計することを推奨する。
      * Tm値(℃)=[(A、Tの数)×2]+[(G、Cの数)×4]-5


  • MightyAmp DNA Polymeraseの場合、イノシンを含むプライマーの使用は避ける。

PCR条件

伸長温度を68℃に設定した3 step PCRが標準条件である。

[ 3 step PCR ]
98℃2 min. *1

98℃10 sec. 30~40 cycles
60℃15 sec.
68℃*21 min./kb

または、
98℃2 min. *1

98℃10 sec. 30~40 cycles
68℃1 min./kb

*1 強力なホットスタート抗体を使用しているため、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させる。
*2 3 step PCRの場合も伸長時間は68℃に設定する。

増副産物の電気泳動

MightyAmp DNA Polymeraseを用いて増幅したPCR産物を電気泳動する場合は、TAE Bufferの使用を推奨する。TBE Bufferを使用すると、泳動パターンがやや裾広がりになり、きれいな泳動結果が得られない場合がある。

PCR産物について

MightyAmp for Cardを用いて増幅したPCR産物のほとんどは3’末端にAが1塩基付加されている。そのため、PCR産物をそのままT-Vector [pMD20(製品コード 3270)、pMD19(Simple)(製品コード 3271)など] にクローニングすることができる。また、Mighty Cloning Reagent Set(Blunt End)(製品コード 6027)で平滑末端化およびリン酸化を行って、平滑末端のベクターにクローニングすることも可能である。

トラブルシューティング

現象問題点対策
増幅しない
増幅効率が悪い
プライマーのTm値上記の式を参考にプライマー設計する
2 step PCR 3 step PCR を試す
3 step PCR 2 step PCR を試す
(3 step PCRで増幅しないものが2 stepで増幅する場合があります)
アニーリング温度 2℃ずつ下げてみる
サイクル数サイクル数を最大40 cyclesまで増やす
サンプルのサイズ直径2 mmで増幅しない場合→直径1.2 mmにする
直径1.2 mmで増幅しない場合→直径2 mmにする
非特異的増幅が著しいプライマーのTm値上記の式を参考にプライマー設計する
3 step PCR 2 step PCRを試す
サイクル数サイクル数を25~30 cyclesに設定

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