リアルタイムPCRの原理

リアルタイムPCR法とは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れています。この方法にはサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムPCR専用の装置が必要です。
リアルタイムPCRによる定量の原理を下図に示します。段階希釈した既知量のDNAをスタンダードとしてPCRを行います。これをもとに、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数(threshold cycle;Ct値)を横軸に、初発のDNA量を縦軸にプロットし、検量線を作成します。未知濃度のサンプルについても、同じ条件下で反応を行い、Ct値を求めます。この値と検量線から、サンプル中の目的のDNA量を測定します。通常、リアルタイムPCRのモニターは蛍光試薬を用いて行います。蛍光モニター法にはいくつかの方法があります。

1) インターカレータ-法

二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター:TB Green)をPCR反応系に加える方法です。インターカレーターは、PCR反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発します。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできます。また、増幅DNAの融解温度を測定することもできます。

(Perfect Real Timeサポートシステムのプライマーは、TB Greenによるインターカレーター法で検出するリアルタイムRT-PCR用です。)

インターカレーター法原理
☆代表的な試薬☆
  2ステップ用試薬
   TB Green Fast qPCR Mix
   TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)

  1ステップ用試薬
   One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
受託サービス
Perfect Real Timeサポートシステム
インターカレーター法(TB Green検出)によるリアルタイムRT-PCR用に最適化されたプライマーを検索・オンライン注文するためのシステムです。ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリ、イネ、シロイヌナズナのRefSeq登録遺伝子またはEnsembl Plants登録遺伝子に対して網羅的にリアルタイムRT-PCR用のプライマーを設計しています。

2) プローブ法(5'-ヌクレアーゼ法)

5′末端を蛍光物質(FAMなど)で、3′末端をクエンチャー物質(TAMRAなど)で修飾したオリゴヌクレオチド(プローブ)をPCR反応系に加える方法です。プローブは、アニーリングステップで鋳型DNAに特異的にハイブリダイズしますが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されます。伸長反応ステップのときに、Taq DNAポリメラーゼのもつ5′→ 3′エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられます。
☆代表的な試薬☆
  2ステップ用試薬
   Probe qPCR Mix

  1ステップ用試薬
   One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
受託サービス
リアルタイムPCR用プライマー・プローブ合成(TaKaRa qPCR Probe)
蛍光標識プローブを用いた特異性の高いリアルタイムPCRに最適なプライマー・プローブ設計サービスです。

3) サイクリングプローブ法

サイクリングプローブ法は、RNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができます。プローブはRNA部分を挟んで一方が蛍光物質(リポーター)で、もう一方が蛍光を消光する物質(クエンチャー)で標識されています。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはありませんが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNaseHによりRNA部分が切断されると、強い蛍光を発するようになります。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができます。サイクリングプローブのRNA付近にミスマッチが存在すると、RNaseHによる切断は起こりませんので、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出が可能です。
☆代表的な試薬☆
  サイクリングプローブ法試薬
   CycleavePCR Starter Kit

   CycleavePCR Reaction Mix
受託サービス
  SNP検出用プライマー&サイクリングプローブの設計
   CycleavePCR Assay Designer (SNPs)

  SNP検出以外の実験系の設計はこちら
   CycleavePCR Assay Designer

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