Mutan™-Super Express Km

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR RR022 RR022 Mutan™-Super Express Km
  • バルクなど特別対応可能
20回 ¥52,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品はODA法(Oligonucleotide-directed Dual Amber法)とLA PCRテクノロジーにより、わずか一日で変異導入操作を終了させるキットである。

内容

(20回分)
TaKaRa LA Taq(5 U/μl)10 μl
10×LA PCR Buffer II(Mg2+ plus) 25 mM100 μl
dNTP Mixture(各2.5 mM)160 μl
Selection Primer(5 pmol/μl)20 μl
Control Synthetic Oligonucleotide(5 pmol/μl)5 μl
Control dsDNA Solution(pKF19kM)(10 ng/μl)5 μl
pKF18k-2 DNA(0.5 μg/μl)10 μl
pKF19k-2 DNA(0.5 μg/μl) 10 μl
E. coli MV1184(10% Glycerol)100 μl

Mutan-Super Express Km(製品コード RR022)中のpKF18k DNA、pKF19k DNAは、それぞれpKF18k-2 DNA、pKF19k-2 DNAと名称変更しましたが、製品内容は従来と全く変わりません。単品販売の製品コード番号、価格、包装量も従来通りです。

保存

-20℃ (ただし、E. coli MV1184のみ-80℃)

GenBankへの登録

Accession Number
 pKF18k:D63846
 pKF19k:D63847
注) pKF18kおよびpKF19kは、マルチクローニングサイト近傍のNde I サイト(CATATG)の前のCが欠失した2,203 bpのもので、GenBankのデータベース上に登録されている。
本製品はNde I部位の前にCが含まれた2,204 bpのplasmidである。

キット以外に必要な試薬 (主なもの)

  • コンピテントセル(E. coli MV1184 Competent Cells)またはエレクトロセル(E. coli MV1184 Electro-Cells)
  • 変異導入用合成オリゴヌクレオチド(5'末端リン酸化済)
  • 抗生物質(カナマイシンなど)
  • 各種培地、プレート

ODA-LA PCR法の原理

本法(ODA-LA PCR法)の原理を図1に示す。
本法では、Mutan-Express Kmの場合と同じベクタープラスミドpKF18k-2/19k-2を使用する。このベクターはカナマイシン耐性遺伝子上に二重のアンバー変異を持っているため、大腸菌MV1184株のようなサプレッサーフリー(sup0)の宿主に導入された場合、その形質転換体はカナマイシン耐性を示すことができない。
このベクターに目的のDNA断片(2 kb以下)を組み込んだ後、変異用オリゴヌクレオチドとアンバーを復帰させるためのセレクションプライマーをPCRプライマーとしてPCRを行うと、その2つのプライマー間のDNA配列が増幅される。つまり「変異導入-セレクションDNA」が生成する。このDNAは同時にPCRのプライマーとなり、ポリメラーゼ反応がさらに進行し、アニーリングを経て、切れ目(ニック)の入った二本鎖環状DNAが形成される。このDNA鎖の伸長過程においては、LA PCRテクノロジーを利用しているので、より長く、より正確なPCR反応が可能である。これをsup0の大腸菌MV1184株に導入すると切れ目部分が連結され、カナマイシンを含む培地で培養するとアンバー変異を持たない、部位特異的変異が導入された形質転換体が得られる。このようにLA PCR→形質転換だけのわずか一日で導入操作が終了する。

図 ODA-LA PCR法の原理

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