制限酵素の活性の定義、純度検定、保存、添付Bufferについて

活性の定義

制限酵素活性の1 Uは、各酵素反応液50 μl中、原則として37℃で1時間に1 μgのλDNAを完全に分解する酵素量とする。なお、活性測定に用いた基質および反応温度については、酵素ごとに記載している。他のUniversal Bufferでの相対活性は、「Universal Buffer・Basal Bufferによる制限酵素活性表示システム」に一括して記載している。

純度検定

各酵素Lotごとに下記の項目を基本にチェックしている。
1. Overdigestion Test
各精製酵素について、基質DNA(通常λDNA)1 μgと過剰量の酵素とを16時間反応させる。その後、アガロースゲル電気泳動のDNA泳動パターンによりnon-specific DNaseの有無を判定している。
2. Genome DNA Analysis
選定した制限酵素(酵素ごとに明記)についてチェックする。適当なBacterial Genome DNA(Agarose embedded、0.5μg DNA/50 μl Gel)に対して、20~150 Uの制限酵素を加え、16時間反応させる。その後パルスフィールド電気泳動を行い、DNA泳動パターンに乱れがないことを確認している。
概要については「Genome DNA Analysis Gradeについて」に一括して記載している。
3. Ligation-Recutting Test
基質DNAに対して、まず、2~50倍過剰の酵素を作用させる。切断されたDNAを回収し、5′末端濃度が0.1~1.0 μMになるようにT4 DNA Ligase Buffer[66 mM Tris-HCI(pH7.6)、6.6 mM MgCl2、10 mM DTT、0.4 mM ATP]に溶解させる。適当量のT4 DNA Ligaseを加え、16℃で1時間あるいは16~18時間反応させる。DNA回収後、制限酵素反応液に溶解させ、同じ制限酵素でDNAを再切断する。以上の結果により、ligase inhibitor、phosphatase、exonucleaseの有無を判定している。なお、Ligation効率、Recutting効率について、タカラバイオの品質規格を「Ligation-Recutting効率品質規格について」に一括して記載している。
4. pKF3 Cloning Test
Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA のマルチクローニングサイトに1ヵ所切断部位を持つ制限酵素について、チェックしている。pKF3 DNAに対し、10倍過剰の制限酵素を作用させる。失活処理の後、切断されたDNAをDNA Ligation Kit Ver.1(製品コード 6021)を用いて16℃で30分間反応させる。この反応液の一部でTH2コンピテントセルを形質転換し、2種類(LB-Cm-Sm、LB-Cm)のプレート上で37℃で二晩培養する。LB-Cm-Smプレート上に出現するコロニーの有無により、ごく微量のexonucleaseの有無を判定している。
概要については、「pKF3 Cloning Testについて」に記載している。

保存温度・保存形状

各酵素とも-20℃で保存(ただし、Aat II については-80℃凍結保存)。
各酵素とも一回程度の凍結溶解であれば失活はみられない。保存形状については、「制限酵素形状一覧表」にその保存緩衝液および組成を一括して記載している。

添付Bufferについて

タカラバイオでは、各制限酵素に活性測定に用いた10×Bufferを添付している。また、全制限酵素に10×Loading Bufferを添付している。

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