-Asn-X-結合の切断に

Asparaginylendopeptidase

  • ●反応用バッファー添付
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製品コード TaKaRa
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TKR 7319 7319 Asparaginylendopeptidase
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製品説明

タンパク質およびペプチドのアスパラギン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に切断する。

保存

-20℃

由来

Jack Bean

活性の定義

DNP-Pro-Glu-Ala-Asn-NH2を基質として、37℃、pH5.0において、1分間に1 μmolのDNP-Pro-Glu-Ala-Asnを生成する酵素活性を1 Uとする。

形状

50% グリセロール、1 mM DTT、1 mM EDTA、0.005% Brij 35を含む20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)溶液

添付Buffer組成(5×)

Asp-EP 5×Buffer 1 ml
【組成:5×】
250 mM 酢酸ナトリウム(pH5.0)
50 mM DTT
5 mM EDTA

純度

その他のプロテーゼ活性は認められない(ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一ではない)。

使用上の注意

本酵素を基質と反応させる場合、激しい撹拌は避けてください。本酵素は高次構造を保ったタンパク質には作用しません。試料タンパク質は必ずカルボキシメチル化(CM化)など化学的手法で変性させてください。

一般的性質

分子量: 37,000(SDS-PAGE)
至適pH: 5.5~6.5
pH安定領域: 4.5~6.5
至適温度: 37~45℃
熱安定領域: 50℃以下
阻害剤: p-choloromercuribenzoate(PCMB)
N-ethylmaleimide(NEM)
変性剤: 尿素 2 M以下
グアニジン塩酸塩 0.5 M以下
SDS 0.05%以下

用途

タンパク質およびペプチドの一次構造解析

活性測定条件


原理
DNP-Pro-Glu-Ala-Asn-NH2を基質として、反応により生成したDNP-Pro-Glu-Ala-AsnをODSカラムで分離し、DNP-Serを内部標準として定量する。

測定法
(試薬)A:基質溶液
0.1 mM DNP-Pro-Glu-Ala-Asn-NH2水溶液
B:0.01 mM DNP-Ser
C:50 mM DTT
D:5 mM EDTAを含む50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)
E:酵素溶液

手順
1.A液10μl、B液10μl、C液5μl、D液20μlを混合し、37℃、2分間プレインキュベーションした後、E液5μl添加により反応を開始する。37℃、20分間反応後、ギ酸5μlを添加し、反応を停止する。
2.反応液をODSカラムを用いたHPLCに供試し、DNP-Pro-Glu-Ala-Asnを定量する。
(HPLC条件)カラム:YMC ODS AP-302、4.4Φ×150 mm
溶媒:60 mM 酢酸アンモニウム緩衝液(pH4.5)/90% アセトニトリル溶液(容量比7/2)
流速:0.7 ml/min
検出:A350

計算式
DNP-Pro-Glu-Ala-Asn(nmol)=
[DNP-Pro-Glu-Ala-AsnのArea]/[DNP-SerのArea]× 0.11)×1.172)
活性(mU/ml)=
[DNP-Pro-Glu-Ala-Asn(nmol)]/[203)× 0.0054)
1)DSP-Ser量(nmol)
2)DSP-Serの吸光系数/DNP-Pro-Glu-Ala-Asnの吸光係数
3)反応時間(min)
4)酵素溶液(ml)

基質特異性


各種の市販合成ペプチドを基質として基質特異性を検討した結果を表1、図1、図2に示す。

表1 Asparaginylendopeptidaseの各種合成ペプチドに対する切断特異性
Peptide Cleavage Site Yielda
Vasoactive
intestinal
peptide(VIP)
1. 66%
2. 38%
3. 43%
4. 21%
5. 3%
Human
1-34
parathyroid
hormone(PTH)
1. 13%
2. 13%
3. 14%
4. 55%
5. 47%
Gastric
lnhibitory
polypeptide(GIP)
1. 20%
2. 13%
3. 2%
4. 36%
5. 31%
Gastrin
related
peptide(GRP)
1. 56%
2. 54%
Pancreatic
polypeptide
(PP)
1. 66%
2. 21%
3. 14%
4. 32%
5. 42%
Neuropeptide Y 1. 56%
2. 54%
Insulin B-chain 1. 33%
2. 21%
3. 26%
Angiotensin I NRVYVHPFHL not cleaved
Neuromedin C GNHWAVGHLM-NH2 not cleaved
Mastoparan INLKALAALAKKIL-NH2 not cleaved

反応
基質:1 nmol
酵素:0.01 mU
溶媒:10 mM DTT、1 mM EDTA含有 20 mM酢酸緩衝液(pH5.0)
液量:100μl
温度:37℃
時間:15 hr

図1 VIPのAsparaginylendopeptidase消化物のHPLC分析 図2 PTHのAsparaginylendopeptidase消化物のHPLC分析

反応生成物の分離
カラム:μBondasphere column(C4 3.9Φ×150 mm)
溶出:0~40%アセトニトリル/0.1% TFA/40 min
流速:1 ml/min
検出:A215

反応生成物の同定
HPLCにより分取したペプチドフラグメントを酸加水分解後アミノ酸組成分析により同定した。

結果
1.-Asn-X-結合以外のペプチド結合の切断は認められなかった。
2.C末端の-Asn-Xは切断された。
3.N末端のAsn-X-及びY-Asn-X-は切断されなかった。
4.Neuropeptide Yの-Asn-Pro-は切断されなかった。

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