Matchmaker™ Gold酵母ハイブリッドシステム概説

新たなタンパク質相互作用の発見

Matchmakerシステムでは、タンパク質間相互作用やタンパク質-DNA間相互作用を同定し、その特徴を明らかにするための製品を豊富に取り揃えています。Matchmakerシステムを利用すると、既知のおとりタンパク質(bait)や特定のDNA配列と相互作用する新規タンパク質をcDNAライブラリーからスクリーニングすることができます。陽性となる相互作用を特定後、共免疫沈降や哺乳類細胞でのツーハイブリッド解析など他のさまざまな方法により確認し、詳細に検討することもできます。
進化型のMatchmaker Goldシステムでは、抗真菌抗生物質Aureobasidin A(AbA)に対する耐性遺伝子を新しいレポーター遺伝子として採用したことで偽陽性の出現を大幅に低減することができ、より確実な陽性クローンの取得が実現します。

相互作用するタンパク質がレポーターの転写を活性化

酵母ツーハイブリッドシステムでは、真核生物転写活性化因子の多くがDNA結合ドメイン(DNA-BD)と活性化ドメイン(AD)という、物理的に分離した2つのモジュラードメインから成ることを利用します。DNA-BDが特異的なプロモーター配列に結合し、ADがRNA Polymerase II 複合体を誘導することで下流の遺伝子が転写されるという仕組みです。各ドメインは独立したモジュールとして働きますが、一方のみでは転写を活性化できません。また、各ドメインを他のタンパク質と融合させても機能は保持されます。Matchmakerシステムでは、研究対象のタンパク質(bait:おとり)をDNA-BDとの融合タンパク質として発現させ、もう一方のタンパク質(prey:獲物、cDNAライブラリー)はADとの融合タンパク質として発現させます。これら2つのタンパク質(baitとprey)が相互作用する場合、DNA-BDとADを含む複合体が形成され、レポーター遺伝子の転写が活性化されることになります(図1)。
Matchmakerシステムでは、バックグラウンドや偽陽性を軽減するため、複数のレポーターの転写活性化を陽性株の選択に利用しています。

複数のシステムを利用可能

Matchmaker Gold酵母ハイブリッドシステムでは、タンパク質間相互作用やタンパク質-DNA間相互作用を探索して確認するための豊富な製品を用意しています。

(1)Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System
AbA耐性遺伝子(AUR1-C)を含む4つの独立したレポーター遺伝子を用いることで偽陽性クローンを効果的に排除できる機能強化型のGAL4ツーハイブリッドシステム。タンパク質-タンパク質間相互作用の確認用。ツーハイブリッドスクリーニングを行うためには、別途、ライブラリー作製キット(2)または酵母形質転換済みライブラリー(3)をご購入ください。

(2)Make Your Own "Mate & Plate" Library System
酵母ツーハイブリッド用preyタンパク質発現cDNAライブラリー作製に必要なSMART反応用試薬、preyタンパク質発現用ADベクター(pGADT7-Rec AD Cloning Vector、linearized)、酵母宿主株(Y187)などからなるキット。SMART技術を用いたcDNA合成と酵母内での相同組換え反応を利用して、100 ng程度のtotal RNAからも効率よく酵母Y187株内にライブラリーを作製。

(3)Mate & Plate Libraryシリーズ
酵母Y187株に形質転換済みのpreyタンパク質発現ライブラリー。ただちに、baitタンパク質を発現する酵母Y2HGold株との接合によるツーハイブリッドスクリーニングに使用可能。ヒト、マウス各組織に由来するcDNAライブラリーや均一化処理済みのノーマライズドライブラリー、さらにUniversal RNAを使用したライブラリーをラインナップ。

(4)Matchmaker Mammalian Two-Hybrid Assay Kits
哺乳類細胞におけるタンパク質-タンパク質間相互作用の確認に使用可能。

(5)pBridge Vector
3つのタンパク質による相互作用を検出するための酵母“three-hybrid”システム構築用ベクター。GAL4ベースのtwo-hybridシステムおよびライブラリーと共に使用可能。

(6)Matchmaker Co-IP Kit
in vitro共免疫沈降を用いてタンパク質相互作用を迅速に同定。化学発光で検出。


図1. 酵母ハイブリッド技術
Matchmakerシステムは、高感度な転写アッセイによりワンハイブリッドやツーハイブリッド、スリーハイブリッドの相互作用を検出する。酵母ツーハイブリッドシステムでは、ゲノム中にレポーター遺伝子をもつ酵母宿主株中で、bait(おとり)およびprey(獲物:ライブラリー)は、それぞれGAL4 DNA-BDまたはADとの融合タンパク質として発現する。
ライブラリータンパク質がbaitタンパク質(ツーハイブリッド)または標的DNA(ワンハイブリッド)と相互作用すると、宿主株はプロモーターの下流に存在するレポーター遺伝子を強く発現する。第3のタンパク質(P)を介してタンパク質が相互作用するスリーハイブリッドな相互作用は、pBridge Vector(製品コード 630404)を用いて検出することができる。
UAS=GAL4応答性上流活性化配列

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