蛍光タンパク質検出用抗体

Clontechでは、Living Colors蛍光タンパク質、フルーツ蛍光タンパク質、あるいはAequorea victoria GFPを検出する多種類のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を販売している。すべての抗体は、特異性を確認しロット間で一定の性能を保証するため、入念に試験されている。

GFP抗体[Full-Length GFP Polyclonal Antibody、A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)]は、野生型のAequorea victoria由来緑色蛍光タンパク質（GFP）ならびにAequorea coerulescens由来のAcGFP1を認識する。これらのタンパク質のN、C末端融合タンパク質の検出に使用できる。

EGFP Monoclonal AntibodyはEGFP全長を抗原として作製したマウスモノクローナル抗体であり、Aequorea victoria EGFP (enhanced green fluorescent protein)の変性体、未変性体、EGFP融合タンパク質、およびdestabilized EGFPを認識する。本抗体は免疫細胞染色や免疫蛍光、免疫組織化学、免疫沈降およびウエスタンブロットに使用できる。また、ECFP、EYFP、EBFP、wtGFP、GFPuv、AcGFP1と交差反応する。

DsRedポリクローナル抗体（製品コード 632496）およびDsRedモノクローナル抗体（製品コード 632392）は、Discosoma sp.の野生型赤色蛍光タンパク質（DsRed）とその変異体であるDsRed1やDsRed2、DsRed1-E5（Fluorescent Timer）、DsRed-Express、DsRed-Express2を認識する。（注：これらの抗体は、DsRed MonomerおよびDendra2は認識しない。）これらの抗体は、認識する赤色蛍光タンパク質のC末端融合体とN末端融合体の両方を検出できる。ウェスタンブロットにおいて、これらはA.v. GFPやその変異体、Heteractis crispa由来の長波長赤色蛍光タンパク質HcRedとは交差反応を示さない。DsRed Polyclonal Antibodyは1,000倍希釈でウェスタンブロットに使用できる。
また、DsRedバリアントからの変異体であるフルーツ蛍光タンパク質も、DsRedポリクローナル抗体またはDsRedモノクローナル抗体によるウェスタンブロットで検出可能である。

Full-Length ZsGreen Polyclonal Antibody

Full-Length ZsGreen ポリクローナル抗体は、Zoanthus sp.緑色蛍光タンパク質（ZsGreen）を特異的に検出する。本抗体は、組換え体のZsGreen1タンパク質全体を抗原としてウサギを免疫し、作製された。ZsGreen1タンパク質に対して高い特異性を有し、サンゴ礁由来蛍光タンパク質（RCFPs）やAequorea sp.由来のAcGFP1など他の蛍光タンパク質とは交差性がない。

mCherry Monoclonal AntibodyはmCherryタンパク質で免疫されたマウス由来のモノクローナル抗体である（Protein A精製、0.5 mg/mlに調製済）。ウェスタンブロットでmCherryのほか、mOrange、mOrange2、mPlum、mStrawberry、mBananaを認識するが、tdTomato、DsRed-Express2、DsRed-Monomerには交差しない（図2 C、D）。N、C末端各融合タンパク質の検出に使用できる。ウェスタンブロットで標準1,000倍希釈での使用を推奨している。

表1. 蛍光タンパク質検出用抗体
＋＝Relative level of effectiveness

図1. サンゴ礁由来蛍光タンパク質（RCFP）に対するAnti-RCFP Polyclonal Pan Antibody（終売）の交差反応性
Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibodyはサンゴ礁由来蛍光タンパク質（AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRed-Express、HcRed、ZsGreen、ZsYellow）を認識するがクラゲ由来のGFPバリアント（EGFP、AcGFP1、EYFPなど）には交差反応性を示さない。HEK 293細胞に次のベクターをトランスフェクションし安定発現細胞株を構築しAnti-RCFP Polyclonal Pan Antibody（1：1000希釈、各レーン：細胞数35,000）を用いてウェスタンブロットを行った。
レーン1：AcGFP1　レーン2：ブランク　レーン3：DsRed-Express　レーン4：AmCyan1　レーン5：ZsGreen1　レーン6：コントロール（トランスフェクション無し）　レーン7：ZsYellow1　レーン8：AsRed2　レーン9：HcRed1

図2. ウェスタンブロットによる各赤色蛍光タンパク質の検出

• パネルA：DsRed Monoclonal Antibodyを用いた各DsRedバリアントの検出
  HeLa細胞に次のベクターを一過性にトランスフェクトし、ウェスタンブロットにより解析した。
  レーン1：pDsRed2-N1　レーン2：pDsRed2-C1　レーン3：pDsRed1-C1　レーン4：pDsRed2-Mito (N-terminal fusion)　レーン5：pDsRed2-Nuc (C-terminal fusion)　レーン6：コントロール（トランスフェクション無し）。反応時間を延長すると、20 kDaの非特異的バンドが現れる。
• パネルB：mCherry Monoclonal AntibodyのmCherryタンパク質に対する特異性
  HEK 293細胞に次のベクターを一過性にトランスフェクトし、mCherry Monoclonal Antibodyを用いてウェスタンブロットを行った。mCherry Monoclonal AntibodyはmCherryタンパク質を認識するがtdTomato、DsRed-Express2、DsRed-Monomerには交差反応性を示さない。
  レーン1：コントロール（トランスフェクション無し）　レーン2：mCherry　レーン3：tdTomato　レーン4：DsRed-Monomer　レーン5：DsRed-Express2、露出時間15秒　レーンM：マーカー
• パネルC：mCherry Monoclonal Antibodyの各フルーツタンパク質に対する特異性
  HEK 293細胞に次のベクターを一過性にトランスフェクトし、mCherry Monoclonal Antibodyを用いてウェスタンブロットを行った。mCherry Monoclonal AntibodyはmCherryの他にmOrange、mPlum、mStrawberryを認識するがmRaspberry、tdTomatoには交差反応性を示さない。
  レーン1：コントロール（トランスフェクション無し）　レーン2：mCherry　Lane3：mBanana　レーン4：mOrange　レーン5：mPlum　レーン6：mRaspberry　レーン7：mStrawberry　レーン8：tdTomato、露出時間5分　レーンM：マーカー

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