本製品は、polyA⁺ RNAからリンカープライマー法^1）により作製したプラスミドDNA型cDNAライブラリーである。制限酵素 Not I 認識部位を有するoligo(dT)₁₈リンカープライマーとBamH I(Bgl II)-Sma Iアダプターを用いて、unidirectional cloningしている。クローニングの前にサイズ分画を行い、約300 bp以下の断片をある程度除去している。ライブラリーは、プレート培養法により1度だけ増幅した菌体（＞1.0×10⁷ cfu/ml）からプラスミド抽出キットを使用して調製している。

cDNAライブラリーに使用しているベクター pAP3neo は、SV40プロモーターを有し、哺乳動物細胞で発現可能である。また、ssDNA生成に必要なf1 ori、in vitro RNA合成のためのT7およびT3 RNAポリメラーゼプロモーターを含んでいる（図1）。
GenBank Accession No. AB003468



図1　pAP3neoの構造

1) Insert cDNAは、pAP3neoのBgl II ^*/ Not Iサイトにクローニングしている。

*	Adaptor, BamH I(Bgl II)-Sma Iを用いてクローニングしているため、クローニング後のBgl IIサイトは潰れている。

2) Xba Iサイトはdam methylaseの影響を受けている。

新規あるいは既知のcDNAのPCRによるスクリーニング

容量：5 μg
形状：10 mM Tris-HCl（pH8.0）, 1 mM EDTA
濃度：200 μg/ml

ラット各種臓器由来のpolyA⁺ RNAよりリンカープライマー法^1）を利用して以下の手順で各cDNAライブラリーを作製している（図2）。制限酵素Not I認識部位を有するoligo（dT）₁₈リンカープライマーとBamH I（Bgl II）-Sma Iアダプターを用いてunidirectional cloningしているが、制限酵素Not I処理からcDNAを保護するため、逆転写酵素（RAV-2由来）による第一鎖cDNA合成時に5-methyl dCTPを取り込ませている。第二鎖cDNA合成、末端平滑化の後、アダプターを付加し、制限酵素Not Iで切断している。遊離のアダプターと短いcDNA断片は、クローニングの前のサイズ分画によりある程度除去している。サイズ分画されたcDNAはNot Iサイト側のみリン酸化されており、一方、ベクターは、制限酵素Not Iで切断した後、脱リン酸化処理を行い、制限酵素Bgl IIで切断しているので、ベクターはBgl IIサイトのみリン酸化されていることになる。これにより、cDNAとベクターとのライゲーションの際に、複数のcDNAがベクターに挿入されたり、ベクター 同士が連結する可能性を低減させている。cDNAとベクターを連結した後、XL1-Blue MRF′を宿主としてエレクトロポレーション法により形質転換を行うことによりcDNAライブラリーを作製している。作製したライブラリーは、液体培養法ではなく、プレート培養法により一度だけ増幅しているため、プライマリーライブラリーのポピュレーションがほぼ保たれている。プラスミド型cDNAライブラリーは、一度だけ増幅した菌体からプラスミドDNAを抽出精製して調製している。


図2　cDNAライブラリー作製法^1）

Pooled from 100 Sprague-Dawley outbred males, ages 10-11 weeks

cDNAライブラリーの品質データを下表に示す。
弊社では、すべてのライブラリーについて以下のテストを行っている。

I. 増幅前のクローン数

II. インサートDNAの確認

クローニング後の平均インサートサイズを、ランダムに拾った15個のコロニーのインサートサイズから求めている。

III. Housekeeping geneのPCRによる増幅

各cDNAライブラリーのプラスミドDNA10 ngをテンプレートとしたPCRにより、次の3種類のcDNAを増幅して検出している。

1. β-actin
   （発現量：high level）
2. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
   （発現量：moderate level）
3. transferrin receptor
   （発現量：low level）

cDNAライブラリー	製品コード	Primary Library Size1） （Independent clone）	Avr. cDNA Size2） （クローニング後）
Rat Liver	9542	6.1×106	1.2 kb

1）	Primary Library Size（Independent clone）	：	増幅前のclone数
2）	クローニング後のAverage Insert Size	：	ランダムに拾った15個のコロニーのinsert sizeの平均値