シアル酸の結合を識別

Cloned α2,3-Sialidase

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製品コード TaKaRa
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製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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資料
TKR 4455 4455 α2,3-Sialidase
  • バルクなど特別対応可能
5 U ¥46,000
説明書・データシート・ベクター情報

仕様変更のお知らせ

本製品はLot. N201AAより、保存温度が-20℃から4℃に変更になりましたのでご注意ください。

保存

4℃

系統名

Acrylneuraminyl hydrolase

酵素番号

3.2.1.18

由来

Cloned from Salmonella typhimurium LT2 and expressed in Escherichia coli

反応

糖鎖中のα-2,3シアリル結合を特異的に切断する。

形状

溶液品〔0.1 M NaCl、0.02%アジ化ナトリウムを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)〕

濃度

50 U/ml

特長

本酵素はクローン体であり、反応時に2価カチオン(Ca2+、Mg2+や安定化剤(BSAなど)の必要がない1,2)

活性の定義

37℃、pH5.5において、3’-sialyllactoseから1分間に1 μmolのシアル酸を遊離する酵素活性を1 Uとする。

一般的性質

分子量 41,300
ミカエリス定数 Km = 0.25 mM(基質:4MUNeu5Ac*
Km = 2.66 mM(基質:PA-GM3:PA-Sugar Chain 029(製品コード 4129))
* 4MU:4-Methylumbelliferyl
至適pH 5.5-7.0(Tris-maleate緩衝液)
5.5-6.0(リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、Tris-HCl緩衝液)
安定化剤 特に必要なし
阻害剤 2-deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminic acid
Ki = 0.38 mM

基質特異性

Substrate Substrate
concentration
Specific activity
(U/mg)
Method*1
4MUNeu5Ac 1.05 mM 1067.8 1
3'-Sialyllactose 1 mM N.T.*2 2
6'-Sialyllactose 1 mM N.T.*2 2
Colominic acid 1 mg/ml N.T.*2 2
PA-Sugar chain 029 2 μM 1.81 3
PA-Sugar chain 030 2 μM N.D.*3 3
PA-Sugar chain 033 2 μM 1.36 3
PA-Sugar chain 036 2 μM 0.92 3
PA-Sugar chain 022 2 μM 3.05×10-3 3
PA-Sugar chain X 2 μM N.T.*2 3
*1 Refer to the other side.
*2 Not Tested (Lot. N201AA-)
*3 Not Detected

PA-Sugar chain X:

Method 1

4MUNeu5Acを基質として下記の条件で酵素反応を行う。
<反応液組成>
2.1 mM 4MUNeu5Ac
 
 
50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)  3 μl
100 mM NaCl 
酵素溶液 3 μl
合計反応液量 6 μl
上記反応液を37℃で10分間保持後、反応液2.5 μlに0.1 Mグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液(pH10.3)1.5 mlを加えて反応を停止する。励起波長350 nm、測定波長448 nmにおける反応液の蛍光強度を測定し、遊離した4-メチルウンベリフェロンを、標準溶液の蛍光強度と比較することによって定量する。

Method 2

0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中、酵素標品10 μlを加えて合計反応液量を100 μlとし、37℃で10分間保持後TBA法3)で遊離のシアル酸を定量する。

Method 3

近藤らの方法4)によりピリジルアミノ化した糖鎖(PA化糖鎖)を基質として、下記の条件で酵素反応を行う。
<反応液組成>
10 μM PA化糖鎖 2 μl
0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)  5 μl
酵素溶液 3 μl
合計反応液量 10 μl
上記反応液を37℃で10分間保持後、100℃で3分間加熱することで反応を停止し、HPLC分析に供する。
<HPLC分析条件>
Column: PALPAK Type R(4.6 mmΦ×250 mm)
Solvent A: 50 mM acetic acid-triethylamine(pH4.0)
Solvent B: Solvent A containing 0.5% 1-butanol
Gradient: 0→50 min 0→50%B
Flow rate: 1.0 ml/min
Detection: Fluorescence(Ex:320 nm, Em:400 nm)
Column temp: 40℃
Injection: 5 μl

純度

1.残存プロテアーゼ活性
本酵素標品10 μlに、0.4 mM酸化インスリンB鎖を含む300 mMリン酸緩衝液(pH7.5)10 μlを加えて、37℃ 16時間反応を行った後、反応液を逆相系HPLCで分析した結果、基質(酸化インスリンB鎖)以外のピークを認めなかった。
2.残存グリコシダーゼ活性
本酵素標品5 μlと糖鎖基質20 pmolとを150 mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5最終液量10 μl)中にて37℃10分間反応させた後、100℃で3分間加熱することで反応を停止し、順相系HPLCで分析した結果、基質以外のピークを認めなかった。
残存グリコシダーゼ活性
α-Fucosidase N.D.
β-Galactosidase N.D.
α-Mannosidase N.D.
Endo-β-N-acetylglucosaminidase N.D.
ND:Not detected

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