生細胞表面のスフィンゴ糖脂質を生理的条件下で切断

EGCase II ACT RE
(Recombinant Endoglycoceramidase II with Activator II)

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 4463 4463 EGCase II ACT RE
  • ライセンス
  • バルクなど特別対応可能
100 mU ¥60,500
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

酸性および中性スフィンゴ糖脂質に作用し、糖鎖部分とセラミド部分の間を加水分解する1,2)。本製品は高度に精製された組換え体EGCase II とタンパク質性のActivator II3,4)の混合物であり、遊離の糖脂質だけでなく、生細胞表面の糖脂質も生理的条件下で分解することが可能であり、細胞表面糖脂質の生理的役割の解析に有効である5~9)
本製品100 μlには組換え体EGCase II 100 mU及びActivator II 50 nmolを含む。

保存

-20℃
(凍結融解により活性が低下するため、融解後、溶液は4℃にて保存し、2~3日で使いきることが望ましい。)

系統名

Oligoglycosylglucosyl-ceramide glycohydrolase

由来

Expressed in Rhodococcus elythropolis carrying plasmid which encodes the EGCase II gene of Rhodococcus sp.

形状

溶液凍結品〔PBS(20 mM phosphate buffered saline, pH7.0)〕

活性の定義

37℃、pH5.0において、GM1から1分間に1 μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素活性を1 Uとする。

活性測定法

0.4% Triton X-100を含む50 mM酢酸緩衝液にて希釈した酵素溶液5 μlを、10 nmolのアシアロGM1および0.4% Triton X-100を含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)5 μlに添加する。37℃で15分間酵素反応を行わせた後、100 μlのcarbonate cyanide溶液を加えて反応を停止し、Park and Johnsonの方法10)で、遊離されたオリゴ糖由来の還元力を測定する。

特異性

セラミドに結合した糖が単糖の場合、例えば、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、スルファチド等には作用しない。セラミドに結合する糖が二糖以上の場合もその還元末端がガラクトースの場合は作用しない。グロボシドには作用しにくい。
グリセロ糖脂質、糖タンパク質には作用しない。

一般的性質

至適pH

pH5.5
pH7~7.5においても約30%の活性を有する。

阻害剤1 mMのHg2+、Zn2+、Cu2+で阻害される。
Ba2+、Ca2+、Mg2+、EDTAでは阻害されない。
5%(v/v) fetus calf serum(FCS)は活性に影響を与えないが10% FCSは活性を半減させる。

純度

α-Galactosidase検出限界以下
β-Galactosidase検出限界以下
α-N-acetylgalactosaminidase検出限界以下
β-N-acetylgalactosaminidase検出限界以下
β-N-acetylglucosaminidase検出限界以下
α-Mannosidase検出限界以下
α-Fucosidase検出限界以下
Sialidase検出限界以下
Endo-β-N-acetylglucosaminidase  検出限界以下
Glycopeptidase検出限界以下
Protease検出限界以下
Sphingomyelinase検出限界以下

使用方法(例)

2×105個の細胞を、20 mU相当のEGCase II ACT RE(20 μl)を含むmodified Eagle's medium(MEM)培地(5% FCS含有)200 μlと共に、37℃で6~16時間、CO2インキュベーター中で反応させる。反応スケールを上げる場合は、EGCase II ACT REの量も増やす。
<培地について>
赤血球のように、細胞によってはPBS(pH7.0)でも使用可能。
FCSは5%までは酵素活性に影響を与えないが、10%になると活性は半減する。
<結果に関する注意>
赤血球等の細胞を除いて一般の生細胞はde novoの糖脂質合成を行うため、細胞表面の糖脂質の分解率は100%には達しない。例えばB16メラノーマ細胞表面の糖脂質GM3(NeuAc)の分解率は16時間で60~70%であるが、糖脂質合成阻害剤D-threo-PDMP(40 μM)を併用すると、16時間でほぼ全ての表面糖脂質が消失する。

遊離の糖脂質に対する基質特異性

Name Structure Hydrolysis
(%)
Ganglio series
GT1b NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100
GD1a NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100
GM1a Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 85
GM3 NeuAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100
Asialo GM1 Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100
Neolacto series
IV6NeuAcα-nLC4 NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100
III3Fucα-nLC4
(Lewis X)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer

3

|
α1Fuc

100
Lacto series
Lactosylceramide Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 83
Cerebrosides
Glucosyl ceramide Glcβ1-1'Cer 0
Galactosyl ceramide Galβ1-1'Cer 0
Sulfatide HSO3-3Galβ1-1'Cer 0
4 mU of the enzyme and 2 nmol activator was incubated with the 10 nmol substrate in 50 mM acetate buffer pH5.5 at 37℃ for 16 hr.
注意:細胞表面の糖脂質を分解する際、グロボシドは本酵素に対して強い抵抗性を示す。

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