免疫組織染色-酵素抗体法

実験操作動画はこちら

免疫組織染色-酵素抗体法(ホルマリン固定パラフィン包埋切片の場合)

ここでは一般的な操作方法をご紹介します。

1. 脱パラフィン
     キシレン 5分
キシレン 5分
キシレン 5分
100%エタノール 5分
100%エタノール 5分
90%エタノール 5分
80%エタノール 5分
流水洗浄 2分
蒸留水
 
2. 抗原賦活処理(抗原がホルマリンによってマスクされている場合)
酵素処理(トリプシン・ペプシン・Proteinase K(製品コード 9034)など)
加熱処理(オートクレーブ・マイクロウェーブ・温浴など)
 
3. ブロッキング
●Peroxidaseで発色する場合は内因性Peroxidaseのブロッキング
3%過酸化水素溶液 5~15分
(凍結切片の場合は0.3%過酸化水素含有メタノール液で
ブロッキングする)
反応後TBS(製品コード T903T9141T9142)または
PBS(製品コード T900T9181T9183)で洗浄
5分
●アビジン-ビオチンの系を使用する場合内因性ビオチンのブロッキング
15 mM NaN3含有0.1%アビジン溶液 10分
反応後TBSまたはPBSですすぎ、TBSまたはPBSで浸漬 5分×1回
15 mM NaN3含有0.1%ビオチン溶液 10分
反応後TBSまたはPBSですすぎ、TBSまたはPBSで浸漬 5分×1回
 
4. 非特異的反応の阻止
ブロックエース粉末
または1%BSA/TBSまたはPBS
5~15分
反応後TBSまたはPBSですすぐ
 
5. 一次抗体の反応
一次抗体(5~10 μg/ml) 室温にて30~60分
25%ブロックエース/TBS or PBS
または1%BSA/TBSまたはPBSで希釈
(2~5 μg/mlの低濃度で4℃一晩反応させてもよい)
反応後TBSまたはPBSですすぎ、TBSまたはPBSで浸漬 5分×3回
 
6. 二次抗体の反応
標識二次抗体を使用する方法(POD標識:製品コード MK200~205, FITC標識など)
ビオチン化二次抗体を使用する方法
ENVISION(DAKO社製)を使用する方法など
 
反応後TBSまたはPBSですすぎ、TBSまたはPBSで浸漬 5分×3回
 
7. 発色(Peroxidaseの発色の場合)
TaKaRa DAB Substrate(製品コード MK210
DAB基質溶液を切片上に滴下する
5~15分
反応停止:
蒸留水で洗い流して蒸留水に浸漬
 
8. 対比染色(核染色)
マイヤーのヘマトキシリン液(または3%メチルグリーン)に浸漬 1~5分
浸漬後、流水で洗浄脱色 10~15分
 
9. 脱水・透徹
80%エタノール
90%エタノール
100%エタノール
100%エタノール
キシレン
キシレン
キシレン
 
10. 封入
マウントメディウムで封入する

実験例

  • 検体:10%中性ホルマリンにて3~10日間固定したパラフィン包埋切片


  • 一次抗体:Anti-Human E-cadherin(HECD-1) 2~10 μg/ml


  • 操作方法:
    1. 脱パラフィン


    2. 抗原賦活処理
      (1) 耐熱性のビーカーあるいは染色バット(電子レンジで使用可能なもの)を2個準備し、その中に切片を浸すのに充分量の10 mM クエン酸バッファー(pH6.0)を加える。
      (2) 脱パラフィンした組織切片を片方の容器に浸して家庭用電子レンジのあたため(調理)モード(約500~900W)で3~5分間照射する。
      (3) 切片をもう一方のバッファーの入った容器に移し替えて、(2)と同様に電子レンジで照射する。ひとつの切片に対して6~8回(約20~40分)繰り返し行ない、照射する毎にバッファーの入った容器を交換する(2つの容器を交互に使用する)。
      (4) 照射後電子レンジから取りだし、そのまま室温で15~20分間放置冷却する。
      (5) TBSに5分間浸す。

      ※通常、カドヘリン抗原安定化のためにカルシウムイオンを添加しますが、組織染色を行う場合、TBSへのCaCl2の添加はとくに必要ありません。
      ※賦活操作中に切片が剥離しないように、スライドガラスは必ずシランコーティングしたものをご使用ください。

    3. 内因性ビオチンブロッキング


    4. 一次抗体反応4℃、一晩


    5. ABC法によりDAB発色


    6. 対比染色(マイヤーのヘマトキシリン液による核染色)


    7. 脱水、透徹、封入
免疫組織染色例(操作方法を動画でご覧ください)
  POD標識二次抗体(製品コード MK200)と 免疫染色用ペルオキシダーゼ基質(製品コード MK210)を使用した例

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