in vitroでsgRNAを調製しスクリーニングするキット

Guide-it™ Complete sgRNA Screening System

  • CRISPR/Cas9ゲノム編集用のsgRNA(single guide RNA)を簡便に調製しスクリーニングするキット
  • 細胞を用いることなく手軽にsgRNAの有効性を評価
  • In vitro transcriptionにより4 μg以上のsgRNAを調製
  • 高品質な組換えCas9タンパク質を使用(核移行シグナル(NLS)付き)
  • sgRNA調製キット、sgRNA評価キットの個別販売あり
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メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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参考
資料
CLN 631438 Z1438N Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit
  • ライセンス
10回 ¥70,000
在庫限りで終売
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説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

Guide-it Complete sgRNA Screening System(製品コード 631439)は、sgRNA合成と評価を行う製品である。本製品はsgRNA合成部分とsgRNAの評価部分の2種類のキットから構成される。
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 631438)は、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムに使用するsingle guide RNA(sgRNAs)をin vitro transcription反応によって調製するキットである。鋳型DNAの調製はPCRによって行うため、鋳型のクローニングは不要で、簡単、高収率にsgRNAを調製することができる。
Guide-it sgRNA Screening Kit(製品コード 631440)は、調製したsgRNAの有効性を、細胞を用いることなくin vitroで評価するキットである。目的細胞への導入前にsgRNAの効果を確認できるため、時間や労力を無駄にすることなく、有効な配列だけをゲノム編集に用いることができる。Guide-it sgRNA Screening Kitは、まず、PCRによってsgRNAターゲットサイトを含む鋳型DNAを作成し、調製した鋳型DNAにsgRNAと組換えCas9タンパク質を作用させ、アガロースゲル電気泳動によって切断効率を確認する。
ゲノム編集でのGuide-itテクノロジーの利用
図1. ゲノム編集でのGuide-itテクノロジーの利用
single guide RNA(sgRNA)は、DNAターゲット配列に特異的に結合するcrRNA配列と、Cas9ヌクレアーゼに結合するtracrRNA配列によって構成されている。ターゲット配列を含むsgRNAが二本鎖DNAニッキング活性を持つ組換えCas9ヌクレアーゼに結合して複合体を形成し、複合体が二本鎖DNA上にあるターゲット配列を特異的に切断する。切断部位にエラーを起こしやすい細胞修復機能が働き、その修復の結果、遺伝子のノックアウト変異が生じる。


Guide-it Complete sgRNA Screening Systemのフローチャート
図2. Guide-it Complete sgRNA Screening Systemのフローチャート


Guide-it Complete sgRNA Screening Systemの操作ステップの概要
図3. Guide-it Complete sgRNA Screening Systemの操作ステップの概要
クローニングフリーのsgRNA産生
図4. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Systemを用いたクローニングフリーのsgRNA産生
製品説明書に従って69 merのプライマーを設計(A-1)し、キットに含まれるHigh Yield PCR EcoDry Premixを用いてPCRを行い、in vitro transcription用の鋳型を調製する。ここまでの操作は4時間以内に終了する(A-2)。次に、in vitro transcription反応によりsgRNAを調製する(A-3)。
(パネルB)AcGFPをターゲットとする配列の異なる2種類の鋳型(T1、T2)をPCRで調製し、電気泳動で約140 bpのバンドを確認した。
(パネルC)PCR産物を精製し、50 ngを用いてT7 in vitro transcriptionを行いsgRNAを作成した後、その品質と収量を電気泳動で確認した。

クローニングフリーのsgRNA産生
図5. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitによる高品質、高収率sgRNA合成
Guide-it In Vitro Transcription Kitの操作手順に従い、6種類のsgRNAを調製した(sample 1-6)。in vitro transcription後、sgRNAのDNase I処理を行い、続いてフェノール処理、イソプロパノール沈殿により精製した。
(パネルA)NanoDrop 2000によりDNA収率を測定した。
(パネルB)Agilent Bioanalyzer 2100によりRNAの質を調べた。
全てのサンプルで、分解のない期待通りのサイズのsgRNAが4 μg以上得られた。

CRISPR Cas9による切断効率の確認
図6. CRISPR/Cas9による切断効率の確認
ヒトクロモゾーム10をターゲットとし、2 kbのフラグメントをPCRで増幅した。増幅フラグメント、増幅フラグメントを切断するように設計されたsgRNA、そしてrecombinant Cas9をGuide-it Complete sgRNA Screening Systemのプロトコールに従って反応させた。
アガロース電気泳動を行った結果、sgRNAが10 ng(Lane 3)および20 ng(Lane 4)のいずれの場合でも、100%の効率で切断が確認された。Lane 2は未処理のコントロールフラグメントである。

内容

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 631438)
・Guide-it sgRNA In Vitro Transcription
Guide-it Scaffold Template(20 ng/μl)50 μl
Guide-it In Vitro Transcription Buffer70 μl
Guide-it T7 Polymerase Mix(33 U/μl)30 μl
RNase Free Water500 μl
・NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.10;10回用)
・High Yield PCR EcoDry Premix (製品コード 639278;24回用)

保存

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up :室温
High Yield PCR EcoDry Premix:室温(20~22℃:デシケーター内で保存)
その他:-20℃

キット以外に必要な機器、試薬

・Recombinant DNase I(RNase-free)(製品コード 2270A)
・Phenol:chloroform: isoamyl alcohol(25:24:1), 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA飽和
・3M 酢酸ナトリウム, pH 5.0
・イソプロパノール
・NucleoSpin Tissue(製品コード 740952.50)
・NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo Scientific, Cat. No. ND-2000)

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