シアル酸の結合を識別
仕様変更のお知らせ
本製品はLot. N201AAより、保存温度が－20℃から4℃に変更になりましたのでご注意ください。
保存
4℃
系統名
Acrylneuraminyl hydrolase
酵素番号
3.2.1.18
由来
Cloned from Salmonella typhimurium LT2 and expressed in Escherichia coli
反応
糖鎖中のα-2,3シアリル結合を特異的に切断する。
形状
溶液品〔0.1 M NaCl、0.02%アジ化ナトリウムを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）〕
濃度
50 U/ml
特長
本酵素はクローン体であり、反応時に2価カチオン（Ca2+、Mg2+や安定化剤（BSAなど）の必要がない1,2）。
活性の定義
37℃、pH5.5において、3’-sialyllactoseから1分間に1 μmolのシアル酸を遊離する酵素活性を1 Uとする。
一般的性質
| 分子量 | ： | 41,300 |
| ミカエリス定数 | ： | Km ＝ 0.25 mM（基質：4MUNeu5Ac*） Km ＝ 2.66 mM（基質：PA-GM3：PA-Sugar Chain 029（製品コード 4129）） * 4MU：4-Methylumbelliferyl |
| 至適pH | ： | 5.5-7.0（Tris-maleate緩衝液） 5.5-6.0（リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、Tris-HCl緩衝液） |
| 安定化剤 | ： | 特に必要なし |
| 阻害剤 | ： | 2-deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminic acid Ki ＝ 0.38 mM |
基質特異性
| Substrate | Substrate concentration |
Specific activity （U/mg） |
Method＊1 |
| 4MUNeu5Ac | 1.05 mM | 1067.8 | 1 |
| 3'-Sialyllactose | 1 mM | N.T.＊2 | 2 |
| 6'-Sialyllactose | 1 mM | N.T.＊2 | 2 |
| Colominic acid | 1 mg/ml | N.T.＊2 | 2 |
| PA-Sugar chain 029 | 2 μM | 1.81 | 3 |
| PA-Sugar chain 030 | 2 μM | N.D.＊3 | 3 |
| PA-Sugar chain 033 | 2 μM | 1.36 | 3 |
| PA-Sugar chain 036 | 2 μM | 0.92 | 3 |
| PA-Sugar chain 022 | 2 μM | 3.05×10－3 | 3 |
| PA-Sugar chain X | 2 μM | N.T.＊2 | 3 |
＊2 Not Tested (Lot. N201AA-)
＊3 Not Detected
PA-Sugar chain X：
Method 1
4MUNeu5Acを基質として下記の条件で酵素反応を行う。
上記反応液を37℃で10分間保持後、反応液2.5 μlに0.1 Mグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.3）1.5 mlを加えて反応を停止する。励起波長350 nm、測定波長448 nmにおける反応液の蛍光強度を測定し、遊離した4-メチルウンベリフェロンを、標準溶液の蛍光強度と比較することによって定量する。
| ＜反応液組成＞ | ||
| 2.1 mM 4MUNeu5Ac | ||
| 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5) | 3 μl | |
| 100 mM NaCl | ||
| 酵素溶液 | 3 μl | |
| 合計反応液量 | 6 μl | |
Method 2
0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）中、酵素標品10 μlを加えて合計反応液量を100 μlとし、37℃で10分間保持後TBA法3）で遊離のシアル酸を定量する。Method 3
近藤らの方法4）によりピリジルアミノ化した糖鎖（PA化糖鎖）を基質として、下記の条件で酵素反応を行う。
上記反応液を37℃で10分間保持後、100℃で3分間加熱することで反応を停止し、HPLC分析に供する。
＜HPLC分析条件＞
| ＜反応液組成＞ | |
| 10 μM PA化糖鎖 | 2 μl |
| 0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5) | 5 μl |
| 酵素溶液 | 3 μl |
| 合計反応液量 | 10 μl |
＜HPLC分析条件＞
| Column： | PALPAK Type R（4.6 mm |
| Solvent A： | 50 mM acetic acid-triethylamine（pH4.0） |
| Solvent B： | Solvent A containing 0.5% 1-butanol |
| Gradient： | 0→50 min 0→50%B |
| Flow rate： | 1.0 ml/min |
| Detection： | Fluorescence（Ex：320 nm, Em：400 nm） |
| Column temp： | 40℃ |
| Injection： | 5 μl |
純度
1．残存プロテアーゼ活性
本酵素標品10 μlに、0.4 mM酸化インスリンB鎖を含む300 mMリン酸緩衝液（pH7.5）10 μlを加えて、37℃ 16時間反応を行った後、反応液を逆相系HPLCで分析した結果、基質（酸化インスリンB鎖）以外のピークを認めなかった。
2．残存グリコシダーゼ活性
本酵素標品5 μlと糖鎖基質20 pmolとを45 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5最終液量10 μl）中にて37℃16時間反応させた後、100℃で3分間加熱することで反応を停止し、順相系HPLCで分析した結果、基質以外のピークを認めなかった。
残存グリコシダーゼ活性
ND：Not detected
本酵素標品10 μlに、0.4 mM酸化インスリンB鎖を含む300 mMリン酸緩衝液（pH7.5）10 μlを加えて、37℃ 16時間反応を行った後、反応液を逆相系HPLCで分析した結果、基質（酸化インスリンB鎖）以外のピークを認めなかった。
2．残存グリコシダーゼ活性
本酵素標品5 μlと糖鎖基質20 pmolとを45 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5最終液量10 μl）中にて37℃16時間反応させた後、100℃で3分間加熱することで反応を停止し、順相系HPLCで分析した結果、基質以外のピークを認めなかった。
残存グリコシダーゼ活性
| α-Fucosidase | N.D. |
| β-Galactosidase | N.D. |
| α-Mannosidase | N.D. |
| Endo-β-N-acetylglucosaminidase | N.D. |
Application
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