ハイスループット対応の全長mRNA解析(シングルセル or 超微量)

SMART-Seq® HT Kit

  • 高感度 - わずか1細胞または10 pg total RNAからcDNA調製が可能(使用範囲:1~100細胞または10 pg~1 ng total RNA)
  • 高品質のRNA-Seqデータ - SMARTer Ultra Low Kitシリーズ中、検出される遺伝子数が最も多い:完全長の遺伝子情報を保持し、rRNAのリード割合が低く、GC richのトランスクリプトも効率よく増幅
  • 簡便なワークフロー - One step RT-PCR反応でcDNAを作製
  • 簡単なサンプル調製 - シングルチューブによるプロトコールで細胞全体を反応に用いるため、ロスがなく調製可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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参考
資料
CLN 634437 Z4437N SMART-Seq® HT Kit
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  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
96回 ¥780,000
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CLN 634438 Z4438N SMART-Seq® HT Kit
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  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
192回 ¥1,080,000
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CLN 634436 Z4436N SMART-Seq® HT Kit
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  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
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480回 ¥2,180,000
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CLN 634439 Z4439N SMART-Seq® HT Lysis Components
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  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
96回 ¥15,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

SMART-Seq HT Kitは、10 pg~1 ng total RNAまたは1~100細胞から直接高品質な全長cDNAをハイスループットに調製することができる。本キットは、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing(SMART-Seq v4)の逆転写およびPCR増幅の性能を損なわずに、シングルステップでより簡便に実施できるプロトコールを採用している。細胞を分離またはRNAを抽出後は、One step RT-PCRを行うだけで二本鎖cDNAが増幅され、その後精製を行うだけで操作が完了する。
cDNA合成は4時間以内に完了でき、ライブラリー構築までを2日以内に完了することができる。SMART-Seq HT Kitは、SMART-Seq v4 Kitと同等の感度と再現性を持つ。
本キットで用いるSMART技術は、スプライスジャンクションや細胞内の選択的スプライシングを含む全長トランスクリプトーム研究には非常に強力なツールであり、完全長の遺伝子を検出できる。Oligo(dT)によるプライミングで、高品質total RNA(RIN>8)またはインタクトな細胞からmRNAを特異的に増幅する。またSMART-Seq v4と同様にLNA技術をとりいれることにより、テンプレートスイッチング効率を向上させ、他のSMARTer Ultra Low Kitより、検出される遺伝子数は増加している。
SMART-Seq HT Kitのフローチャート
図1.SMART-Seq HT Kitのフローチャート
SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT kit のワークフローの比較
図2.SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kit のワークフローの比較

SMART-Seq HT(右)は、SMART-Seq v4のプロトコール(左)を改変することにより、簡便でハイスループットなワークフローで行える。セルソーターによりシングルセルを取得した後、SMART-Seq v4 Kitの場合、6つのハンズオンステップが含まれるが、SMART-Seq HT Kitの場合は、3つのハンズオンステップのみで行える。SMART-Seq HTワークフローの重要なステップは、効率的な逆転写およびPCR cDNA増幅のために最適化されたOne-Step RT-PCR Bufferを使用してOne-Step RT-PCRを行うことである。 One-Step RT-PCR BufferはLysis Bufferを添加する必要がなく、AMPureビーズ精製が可能である。SMART-Seq HT Kitは、従来のSMART-Seq v4 Kitと同様に、シーケンス用のライブラリー調製(Nextera XT)の前に、調製したcDNAの検証(定量、サイズ分布)が必要である。

SMART-Seq v4 KitおよびSMART-Seq HT Kitを用いて、セルソーターで分離した293T細胞から得られた遺伝子発現データの再現性比較
図3.SMART-Seq v4 KitおよびSMART-Seq HT Kitを用いて、セルソーターで分離した293T細胞から得られた遺伝子発現データの再現性比較

SMART-Seq v4 Kit(SSv4_1~SSv4_12)およびSMART-Seq HT Kit (HT_1 to HT_9)を用いて、293T細胞の21個のシングルセルからライブラリーを作製し、各細胞について得られた遺伝子発現の再現性を評価した。
階層的クラスタリングヒートマップは、細胞間のユークリッド距離を示し、0.74から0.97の範囲のピアソン相関を示した。最良の相関関係は同一キットで調製された細胞間で観察されるが、2つのキット間の相関関係も非常に高く、キットの違いによるクラスター化はしていない。これらのデータより、簡便ワークフローを採用したSMART-Seq HTはSMART-Seq v4と比較して、遺伝子発現解析において大きな偏りがないことを示した。

SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kitを用いたGC含量の違いによる遺伝子発現レベルの比較
図4.SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kitを用いたGC含量の違いによる遺伝子発現レベルの比較

マウス脳のtotal RNA 10 pgから作製したライブラリーを、GC含有量(≦36%、37~54%、≧55%)についてさらに分析した(パネルA)。遺伝子をGC含量で分類し、スキャッタープロットを使用して各分類内の遺伝子の発現レベル(FPKM)の再現性を視覚化した。遺伝子発現レベルはSMART-Seq v4(パネルB)またはSMART-Seq HT Kit(パネルC)を用いた場合でも、replicate間において非常に高い再現性を示した。高または低GC含量の遺伝子(それぞれ赤色および青色で示す)は、SMART-Seq v4 KitとSMART-Seq HT Kit(パネルD)間においても同様の発現レベルを示した。このように、SMART-Seq HT Kitで採用されているOne step RT PCR反応は低および高GC含量遺伝子の発現に影響を与えなかった。

SMART-Seq v4 KitおよびSMART-Seq HT Kitで同定されたトランスクリプトのオーバーラップ
図5.SMART-Seq v4 KitおよびSMART-Seq HT Kitで同定されたトランスクリプトのオーバーラップ

マウス脳 total RNA10 pgから調製したライブラリーを、各キット内のreplicate間で検出されたトランスクリプト(FPKM>0.1)のオーバーラップ数について評価した結果、各キットにおいて非常に類似していた(SMART-Seq v 4:61%、SMART-Seq HT:63%)(パネルB)。また、各キットの3つのreplicateすべてによって同定されたトランスクリプトを互いに比較した結果、71%のオーバーラップ率を示した。オーバーラップしているトランスクリプトの発現量は平均37 FPKMだが、一方のキットでのみ同定されたトランスクリプトは少なく、発現量が平均6~7 FPKMであった。

内容

SMART-Seq HT Kit(製品コード 634437、634438、634436)

Box 1:Control Total RNA (1 μg/μl)

Box 2:SMART-Seq HT Oligonucleotide
3' SMART-Seq CDS Primer II A
RNase Inhibitor (40 U/μl)
One-Step Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
SeqAmp DNA Polymerase
10X Lysis Buffer
Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)
Nuclease-Free Water

SMART-Seq HT Lysis Components(製品コード 634439)
    3' SMART-Seq CDS Primer II A
    10X Lysis Buffer

輸送

-70℃

保存

Box 1 :-70℃
Box 2 : -20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機(1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)
  • 96ウエルプレート用遠心機
セルソーティング
  • 96-well polycarbonate PCR plates (USA Scientific Plastics, Cat No. 2796-3330)
  • BD FACS Pre-Sort Buffer (BD, Cat No. 563503)
  • チューブ・プレート用クーリングブロック(-20℃で保存してあらかじめ冷やしておく)
  • Adhesive PCR Plate Foils (Thermo Fisher Scientific, Cat No. AB-0626)
  • ドライアイス (細胞の凍結用)
  • (オプション) SMART-Seq HT Kit Lysis Components(製品コード 634439)
One-Step RT PCR増幅およびバリデーション
  • Hot-Lid PCRサーマルサイクラー
  • High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. No. 5067-4626) a
  • Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit (Agilent, Cat. No. 5067-1504)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Cat.No. 1402-4700)
  • Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes (USA Scientific社 Cat.No. 1415-2600) またはLoBond tubes (Eppendorf, No.022431021)
SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter社; 5 ml, Cat.No. A63880、60 ml, Cat.No. A63881)
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device (SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip :製品コード 635011)など
  • 96-well フォーマットmagnetic separation device (オプション)

    96-well V-bottom Plate (500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996)
    MicroAmp Clean Adhesive Seal (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 4306311)
    96-well plate用遠心機

  • 80% Ethanol
  • DynaMag-2 Magnet (Thermo Fisher Scientific Cat.No.12321D) またはMagnetic Stand(製品コード 631964)(精製前にNexteraシーケンス用ライブラリーをプールした場合)

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