シングルセルまたはtotal RNA 10 pgからの方向性情報を持ったtotal RNA-seq解析

SMART-Seq® Stranded Kit

  • 1~1,000個の細胞ダイレクトまたは微量(10 pg~10 ng)のtotal RNAから7時間でRNA-seq用ライブラリーを調製
  • シングルセルから方向性情報を持った全長total RNAシーケンスが可能
  • シングルセルまたはtotal RNAからコーディング/ノンコーディングのトランスクリプトを再現性高く正確に検出
  • 分解を受けたRNAからもライブラリー調製可能
  • 対象生物種はヒト、マウス、ラット
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 634442 Z4442N SMART-Seq® Stranded Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
12回 ¥188,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 634443 Z4443N SMART-Seq® Stranded Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
48回 ¥658,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 634444 Z4444N SMART-Seq® Stranded Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
96回 ¥870,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

SMART-Seq Stranded Kitは、1~1,000個の細胞または10 pg~10 ngのtotal RNAから、方向性情報を持ったイルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリー調製ができるキットである。高い再現性と均一なGene Bodyカバレッジを示し、GCリッチな転写産物も正確に検出できる。 本キットではSMART(Switching Mechanism at 5' End of RNA Template)テクノロジーを用いており、完全長のトランスクリプト情報を取得するため、転写産物のアイソフォーム、融合遺伝子、点変異などの解析が可能である。また本キットでは、ライブラリー調製中に、リボゾーム由来のDNAを除去することができるため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はない。
本キットはランダムプライマーによるcDNA合成を行うため、すべてのトランスクリプトをキャプチャーし、分解の進んだ低品質RNAでも使用可能である。高品質RNAを用いてオリゴdTプライマーによるcDNA合成を行いたい場合はSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingをお勧めする。

また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット(別売)も使用可能である。
実験フローチャート
図1.実験フローチャート
SMART-Seq Stranded Kitを用いて作製された最終ライブラリーの構造
図2.SMART-Seq Stranded Kitを用いて作製された最終ライブラリーの構造

PCR1で付加されたアダプターは、イルミナ社次世代シーケンサーのフローセルへの結合部位(P7、P5)およびIndex(Index 1 [i5]、Index 2 [i7])配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1は元のRNAのアンチセンスの配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス鎖の配列が得られる。Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はSMART-Seq Stranded Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピング前にトリミングする必要がある。


表1.異なるRNA input量から調製したライブラリーの評価
Sequencing alignment metrics for 10 pg–10 ng total RNA
RNA source Human brain total RNA
Input amount (ng) 10 1 0.25 0.05 0.01
Number of reads (paired-end) 2,500,000 2,500,000 2,500,000 2,500,000 1,000,000
Number of transcripts > 1 FPKM 15,128 15,097 15,066 14,394 13,151
Number of transcripts > 0.1 FPKM 23,864 23,631 23,274 21,335 16,700
Pearson/Spearman correlations 0.99/0.87 0.99/0.85 0.99/0.82 0.97/0.68 0.92/0.46
Correct strand per biological annotation (%) 97.7 97.8 97.6 97.5 97.1
Proportion of reads (%):
 Exonic 37.1 36.5 41.5 39.7 34.1
 Intronic 36.1 35.6 36.7 35.4 30.6
 Intergenic 8.6 8.5 8.8 8.7 7.4
 rRNA 9.7 9.6 3.6 4.1 6.7
 Mitochondrial 5.2 6.3 6.4 6.4 5.9
Overall mapping (%) 96.8 96.4 97 94.4 84.7
Duplicate rate (%) 13.3 20.2 35.2 59.0 62.4

ヒト脳の total RNA(10 pg~10 ng)から本キットと用いて、RNA-seqライブラリーを作製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
本表のデータは、三連の実験の平均を示し、わずか10 pgのRNA input量の場合でも非常に高い再現性(Pearson/Spearman)を示した。


SAMART-seq Stranded Kitと Pico v2 Kitの最小インプット量の比較
図3.SMART-Seq Stranded Kitと Pico v2 Kitの最小インプット量の比較

Panel A:ヒト脳のtotal RNA(50 pg~10 ng)を用いてSMART-Seq Stranded KitおよびSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian(Pico v2)を用いてRNA-seqライブラリーを三連で作製した。取得したデータは250万リード(paired-end)で解析を行った。
Pico v2 KitのインプットRNAの範囲(250 pg~10 ng)では、両キットでほぼ同等の性能を示したが、1 ng以下では、SMART-Seq Stranded Kitのほうがより多くのトランスクリプトを検出した。
Panel B:50 pgの total RNAから各々のキットで作製されたライブラリーを用いて発現解析を行い、再現性を比較した。
SMART-Seq Stranded Kit(Pearson=0.97)は50 pg total RNAにおいてもPico v2(Pearson=0.92)よりも高い再現性を示した。

Sequencing alignment metrics for A375 total RNA and cells
Input Total RNA 1,000 cells 500 cells 100 cells 10 cells 5 cells 1 cell
Number of reads (pairs) 6,000,000 6,000,000 6,000,000 6,000,000 6,000,000 6,000,000 5,873,974
Number of transcripts
>1 FPKM
13,260 13,294 13,583 13,520 12,726 12,602 11,540
Number of transcripts
>0.1 FPKM
21,334 21,113 21,365 21,145 20,550 18,888 15,815
Proportion of reads(%):
 Exonic 34.7 36.4 39.2 42.7 36.7 36.2 37.3
 Intronic 29.6 29.3 27.7 28.3 34 30.4 21.1
 Intergenic 14.2 13.4 12.2 12.9 16.7 16.8 10.1
 rRNA 7.0 11.4 11.5 6.3 3.6 4.9 7.1
 Mitochondrial 4.1 3.5 3.7 4.9 3.8 4.4 4.6
Overall maping (%) 89.6 93.9 94.3 95.1 94.9 92.7 80.2
Duplicate rate(%) 37.3 45.2 40.3 46.1 52.5 72.2 78.5
lncRNA mapping:
Number of mapped reads(%) 7.2 10.4 10.8 9.4 8.7 8.6 7.3
lncRNA transcripts detected 5,395 4,687 4,565 5,439 5,440 4,983 2,802
異なる細胞インプット量で高い再現性
図4.異なる細胞インプット量で高い再現性

セルソーティングによって単離されたA375細胞から、SMART-Seq Stranded Kitを用いてライブラリーを作製した。インプットした細胞数は1細胞から1,000細胞で、5~1,000細胞は二連、1細胞は12連で行った。 比較のために1,000細胞から精製したtotal RNAを用いて二連でライブラリーを作製した。
Panel A: 1~1,000細胞から調製したライブラリーの評価
Panel B: Panel Aに示された全てのサンプル間のユークリッド距離を表示した階層的クラスタリング解析。Pearson相関係数は0.85から0.99を示した。シングルセルはCell1~Cell12と表示し、他のインプット量の細胞のレプリケートはa~bと表示している。

内容

Box 1
SMART scTSO Mix
scR-Probes
Control Total RNA (1 μg/μl)
Box 2
scZapR v2
SMART scN6
scRT Buffer
SMARTScribe RT (100 U/μl)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
ZapR Buffer (10X)
Tris Buffer (5 mM)
PCR2 Primers v2
Nuclease-Free Water
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer (2X):
10X Lysis Buffer


Indexing Primer Set:
12回用(製品コード 634442)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-12
3' PCR Primer HT Index 2 (3' 2;12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1~12 (5' 1~12; 12.5 μM)
48回用(製品コード 634443)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2- 48
3' PCR Primer HT Index 1~4 (3' 1~4; 12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1~12 (5' 1~12; 12.5 μM)
96回用(製品コード 634444)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-96
3' PCR Primer HT Index 1~8 (3' 1~8; 12.5 μM)
5' PCR Primer HT Index 1~12 (5' 1~12; 12.5 μM)

保存

Package 1:-70℃
Package 2:-20℃
Indexing Primer Set:-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
    (Final RNA-Seq Library Amplificationのステップを100μlの反応液でPCRを行うため、100 μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50 μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。)
  • フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 0.2 ml tube minicentrifuge
  • 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI Cat. No. 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block (Light Labs Cat. No. A-7079)

セルソーティング
  • 96-well polycarbonate PCR plates (USA Scientific社 Cat.No . 2796-3330) or 8-tube strips (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0264) inserted into a PCR rack
  • BD FACS Pre-Sort Buffer (BD Cat No. 563503)
  • Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS without Ca2+ and Mg2+;) (Sigma-Aldrich 社 Cat. No. D8537)
  • Adhesive PCR Plate Foils (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0626) or 8-cap strips (Thermo Fisher Scientific社 Cat No. AB-0784)
  • ドライアイス

PCR増幅およびバリデーション
  • Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Cat No.5067-4626)
  • Qubit dsDNA HS kit (Thermo Fisher Scientific Cat. No. Q32851)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)
  • Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)

SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit(5 ml; Beckman Coulter社; 5 ml Code. A63880、60 ml Code. A63881)
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device (SMART-Seq Magnetic Separator –PCR Strip :製品コード 635011)
  • 80% Ethanol(用時調製)

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注意事項
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