微量FFPEサンプルからもRNA-Seqが可能

SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian

  • ヒト、マウス、ラットの微量(250 pg~)のtotal RNAからRNA-Seq解析が可能
  • FFPEやLCM由来の分解を受けたRNAやcell-free RNAを含むすべての品質のRNAから信頼性の高い結果を取得
  • シーケンス結果の改良 ― PhiXを添加しなくても高いクラスターpassing filter(% PF)が得られる
  • すべての工程が6時間で完了する迅速プロトコール
  • PCRバッファーの改良により、ライブラリー精製の効率がアップ
  • 最大96インデックスの設定が可能なイルミナ社NGS装置対応のライブラリー作製
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製品コード TaKaRa
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CLN 634411 Z4411N SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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12回 ¥198,000
¥158,400
2017/07/03~
2017/08/31

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CLN 634412 Z4412N SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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48回 ¥700,000
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CLN 634413 Z4413N SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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96回 ¥930,000
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CLN 634414 Z4414N SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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192回 ¥1,680,000
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※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalianは、250 pg~10 ngのヒト、マウス、ラットtotal RNAからイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを効率よく作製するキットである。本キットは、高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNAでも使用することができる。インデックスとアダプターを付加したstrand-specific RNA-Seqライブラリーを、逆転写反応、PCR増幅のステップも含めた一連の操作により作製できる。
従来品に比べてv2キットは、イルミナ社シーケンサーにおけるシーケンスのパフォーマンスを改良する工夫がされており、また、より使いやすいライブラリー精製のワークフローになっている。
total RNA中に含まれるリボゾームRNA(rRNA)(および一部ミトコンドリアRNA)は、rRNA特異的プローブを使用した独自技術を採用することにより、効率的に除かれる。その結果、シーケンスコストを下げ、マッピング精度(mapping statistics)を上げることができる。
v2キットで作製されたライブラリーは従来のキットで作製されたライブラリーとは異なる設計になっており、イルミナ社のNGS装置を使用する際、大量のPhiXを添加しなくても高いClusters passing filter(% PF)を得ることができる。その結果、シーケンスの1ランあたり、より生物学的に有意義なリードを得ることができるので、シーケンスコストを下げることができる。v2キットを用いたデータはrRNAやmtRNAにマッピングされるリードが少なく、duplicateの割合も低いため、よりユニークなtranscriptsを識別する傾向がある。さらにv2キットはPCR Bufferの組成を改良したことにより、ライブラリー精製の効率が増大した。

本キットには、12、48、96および192回用の製品があり、96回用および192回用(製品コード 634413、634414)の製品には12種類のReverseプライマーと8種類のForwardプライマーが含まれており、ハイスループット解析用に最大96インデックスが設定できる。

図1. 実験フローチャート
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianを用いて作製された最終ライブラリーの構造
図2. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianを用いて作製された最終ライブラリーの構造

5' PCR Primer HTおよび3' PCR Primer HTにより付加されたアダプターは、イルミナ社シーケンサーのフローセルへの結合部位(P7、P5)およびイルミナ社 TruSeq HT Index(Index 1 [i5]、Index 2 [i7])の配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる(元のRNAの方向は 5’→3’になる)。
Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はPico v2 SMART Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピングの前にトリミングする必要がある。

 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによるpassing-filter rate(% PF)の改善
図3. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによるpassing-filter rate(% PF)の改善

従来のキット(Pico v1)と本キット(Pico v2)を用いて作製したライブラリーを、NextSeq 500またはMiniSeqを用いてシーケンスを行った。それぞれのグラフにおいて、青い枠の部分はunfiltered (raw) リードのクラスター密度の分布を示している。一方、緑の枠の部分はfilteringを行ったリードのクラスター密度の分布を示している。
Passing filterのリード数(M:million)と%PFの値をグラフの上に表記した。
イルミナ社の規格では、予想されるPassing filterのリード数は、NextSeqの場合は130 M、MiniSeqの場合は25 Mである。PhiXはPico v2キットでは1%、Pico v1キットでは10%添加している。
Pico v2キットの場合、PhiXにアライメントされたリードの割合はすべてのシーケンスランにおいて、0.5%から1.15%の間である。
上記のグラフの結果により、Pico v2キットで作製されたライブラリーは、Pico v1キットに比べて高い% PFの値が得られた。

 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによる感度と再現性の改善
図4. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによる感度と再現性の改善

1 ngまたは10 ngのヒト肺FFPE組織から抽出したTotal RNAから、従来のキット(Pico v1)および Pico v2キットを用いてライブラリーを調製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
Panel A:1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーの評価
どちらのinput量においてもPico v2を用いた場合、ライブラリーの収量が多く、rRNAやmtRNAにマッピングされるリード数の割合や、Duplicateの割合が低かった。1 ngのinputではPico v2のライブラリーから得られたシーケンスデータでは、Pico v1の場合に比べて数千以上多くのTranscript数が得られ、Pico v2では高い感度での解析が可能になった。
Panel B : 1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーのFPKMs(Fragments Per Kilobase of Exon Per Million Fragments Mapped)の相関性
Pico v2キットを用いた場合、Pico v1キットに比べて1 ngと10 ngのinputのデータにおいて高い再現性が見られた。FPKMの値はlog10 scaleで表示している。

内容

Package 1:
SMART TSO Mix v2
R-Probes v2
Control Total RNA (1 μg/μl)

Package 2
ZapR v2
SMART Pico Oligos Mix v2
5X First-Strand Buffer
SMARTScribe RT (100 U/μl)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
10X ZapR Buffer
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer (2X):
Tris Buffer (5 mM)
PCR2 Primers v2
Nuclease-Free Water

Indexing Primer Set:
12回用(製品コード 634114)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-12
3’ PCR Primer HT Index 2 (3’ 2; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1~12 (5’ 1~12; 12.5 μM)

48回用(製品コード 634412)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2- 48
3’ PCR Primer HT Index 1~4 (3’ 1~4 ; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1~12 (5’ 1~12; 12.5 μM)

96回用(製品コード 634413)、192回用(製品コード 634414)
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-96(192回用は2個含まれる。)
3’ PCR Primer HT Index 1~8 (3’ 1~8; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1~12 (5’ 1~12; 12.5 μM)

保存

Package 1:-70℃
Package 2:-20℃
Indexing Primer Set:-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
  • シングルチャンネルピペット:10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
    (Final RNA-seq Library Amplificationのステップを100μlの反応液でPCRを行うため、100μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。)
  • フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 0.2 ml tube minicentrifuge
  • 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI社 Code 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block(Light Labs社 Code A-7079)

PCR増幅およびバリデーション
  • Agilent High Sensitivity DNA Kit(Agilent社 Code 5067-4626)
  • Qubit dsDNA HS kit(Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(USA Scientific社;0.2 ml Code 1402-4700)
  • Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)

SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit(Beckman Coulter社; 5 ml, Code A63880、60 ml, Code A63881)
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device(Magnetic Separator - PCR Strip:製品コード 635011)
  • 80% Ethanol(用時調製)

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注意事項
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