ヒトBCR H鎖/L鎖の可変領域の完全長シーケンス

SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit

  • インプットサンプル:末梢血単核細胞(PBMC)から精製したtotal RNA 10 ng~1 μgまたはB細胞から精製したtotal RNA 1~100 ng
  • UMIによるPCRエラー、duplicate、シーケンスエラーに由来するリードの補正
  • 最適化されたcDNAライブラリー作製による高感度で特異的なクロノタイプ検出
  • ヒトIgGサブクラスの正確な増幅とシーケンスによる同定
  • 同一サンプルから異なる鎖(IgG、IgM、IgK、IgL)を高感度に検出するための最適化されたPCR条件
  • Takara Bio Immune Profiler Softwareによるシーケンスデータ解析のための完全なワークフロー
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メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
キャンペーン価格
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データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 634466 Z4466N SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
  • NGS関連 -RNAシーケンス編-
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
12回 ¥180,000
¥144,000
2020/05/25~
2020/08/31

説明書・データシート・ベクター情報
CLN 634467 Z4467N SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
  • NGS関連 -RNAシーケンス編-
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
48回 ¥580,000
¥464,000
2020/05/25~
2020/08/31

説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitは、5'RACE法とNGSテクノロジーを組み合わせることにより、RNAサンプルから、ヒトBCRプロファイリングの高感度で正確かつ最適化されたアプローチを提供する。5'RACE法の採用によりバイアスを減らし、BCRのH鎖またはL鎖の定常領域からのプライミングを可能にする。本キットは、遺伝子特異的増幅におけるこれらの利点を組み合わせて、BCR転写産物のV(D)J可変領域全体をキャプチャーし、高感度で再現性の高いB細胞レパトア解析を可能にする。
本キットは、末梢血単核細胞(PBMC)から10 ng~1 μgのtotal RNAまたはB細胞から1~100 ngのtotal RNAから高品質のイルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製し、ヒト免疫グロブリンIgGおよびIgMのH鎖およびL鎖(κ鎖、λ鎖)の両方のデータが得られる。このプロファイリングキットには、分子バーコード(UMI)が含まれており、PCRエラー、duplicateやシーケンスエラーに由来するリードを除去できるため、より正確で信頼性の高い結果が得られる。シーケンス完了後、Takara Bio Immune Profiler Softwareでデータを解析することが可能である。このソフトウェアは、UMIベースのエラー補正を使用し、MIGEC(Shugay、2014)およびMiXCRソフトウェア(Bolotin、2015)を使用可能である。本ソフトウェアは、クロノタイプカウント、V(D)J領域の識別および配列情報を含む、高品質のBCRプロファイリング解析を可能にする。
IgG IgM H/K/L Profiling Kitのワークフローと2段階PCR
図1.Panel A  SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitのワークフロー
    Panel B  BCR IgGの可変領域のcDNA増幅のための2段階PCR
Panel A. SMARTScribe Reverse Transcriptase による1st strand cDNA合成を行い、mRNAの5'末端に達するとテンプレートに依存しないヌクレオチドが付加される。
SMART UMI Oligoは、この付加されたヌクレオチドにアニーリングし、逆転写反応によってヌクレオチドの追加配列をfirst stranded cDNAに組み込むためのテンプレートとして機能する。(これがtemplate switching ステップに相当する)。次に、1 st strand cDNAを用いて2段階の遺伝子特異的PCR増幅を行う。(Panel Bの詳細を参照)。nested PCRの2 nd PCRの産物は、大部分のリードがB細胞受容体転写物にマッピングされる。
Panel B. 1st PCRは1st strand cDNAをテンプレートにして、イルミナの Read 2 Primer配列と相補的なフォワードプライマー(PCR1 Universal Forward primer)とBCRの H鎖またはL鎖の定常領域(非可変領域)に相補的なリバースプライマー(PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer)で行う。
Read 2 Primer配列と定常領域から増幅することにより、1st PCRではBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と大部分の定常領域を特異的に増幅する。2nd PCRは 1st PCRの産物をテンプレートにして、semi-nested プライマー(PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer)を使用してBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と定常領域の部分を増幅する。
1~100 ngのB細胞RNAから同定されたクロノタイプカウント
図2.1~100 ngのB細胞RNAから同定されたクロノタイプカウント

1 ng、10 ng、および100 ngのヒトCD19B細胞由来total RNAから本製品を用いてBCRプロファイリングIgG、IgM、IgK、およびIgLライブラリーを作製した。1 ng、10 ng、100 ngのRNAインプットのライブラリーに対して、各々100,000リード、400,000リード、5,000,000リードにダウンサンプリングして、Takara Bio Immune Profiler Softwareによって解析した。インプットRNA量が増えるとクロノタイプカウントが増加し、RNA量が少なく複雑性の高いサンプルでも安定したデータが取得された。

1 μgのPBMC RNAから作製されたライブラリー間の再現性を示すスキャッタープロット
図3.1 μgのPBMC RNAから作製されたライブラリー間の再現性を示すスキャッタープロット

健常人ドナーからのPBMC由来のRNA 1μgからIgG、IgM、IgK、およびIgLのライブラリーを2連で作製した。ライブラリーは13Mリードにダウンサンプリングして解析された。プロットには、複製した4つのライブラリー(IgG、IgM、IgK、およびIgL)がすべて含まれている。1 μgのPBMC RNAを用いて行った場合、ピアソン相関係数は0.98、スピアマン相関係数は0.72になり高い再現性を示した。

さまざまなドナーから取得したPBMC RNAのクロノタイプカウント
図4.さまざまなドナーから取得したPBMC RNAのクロノタイプカウント

8人のドナー(異なる色で表示)からのPBMC RNAの各10 ngからSMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用してIgG、IgM、IgK、およびIgLクロノタイプを決定した。解析はすべて100,000リードにノーマライズされた。クロノタイプカウントはサンプルによって異なるが、本キットを使用すれば様々なクロノタイプが検出された。

10 ng PBMC RNAライブラリーのシーケンス飽和の評価
図5.10 ng PBMC RNAライブラリーのシーケンス飽和の評価
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用して単一ドナーからのPBMC RNA10 ngからBCR Profilingライブラリーを調製した。
Panel A. 異なるシーケンスdepthでのIgGクロノタイプカウントを、UMIベースのエラー補正あり(青線)となし(紫線)で示した。 IgGおよびその他の鎖(IgM、IgK、およびIgLは未掲載。)をライブラリーごとに150万リードで配列決定し、100万、500K、200K、100K、50K、10K、および5Kリードにダウンサンプリングした。さまざまなシーケンスdepthで、Takara Bio Immune Profiler Softwareで解析を行った。UMIを用いることで、正確性の高いクロノタイプを検出した。
Panel B. 100K(低depth)および1,500K(高depth)のライブラリー間で重複したクロノタイプを示した。

内容

Package 1:
Control Total RNA (1 μg/μl)
SMART UMI Oligo

Package 2:
BCR Enhancer
First-Strand Buffer
dT Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
Elution Buffer (10 mM)
Nuclease-Free Water
PrimeSTAR GXL SP DNA Polymerase (1.25 U/μl)
5X PrimeSTAR GXL Buffer
dNTP Mixture (2.5 mM each)
hBCR PCR1 Universal Forward
hBCR PCR1 IgG Reverse
hBCR PCR1 IgM Reverse
hBCR PCR1 IgK Reverse
hBCR PCR1 IgL Reverse

Package 3:
12回用(製品コード 634466)
  hBCR PCR2 IgG Reverse 1
  hBCR PCR2 IgM Reverse 1
  hBCR PCR2 IgK Reverse 1
  hBCR PCR2 IgL Reverse 1
  hBCR PCR2 Forward 1-12

 48回用(製品コード 634467)
  hBCR PCR2 IgG Reverse 1-4
  hBCR PCR2 IgM Reverse 1-4
  hBCR PCR2 IgK Reverse 1-4
  hBCR PCR2 IgL Reverse 1-4
  hBCR PCR2 Forward 1-12

保存

Package 1:-70℃
Package 2,package 3:-20℃
   BCR Enhancer, Nuclease-Free Water:-20℃保存。一度融解した後は4℃保存
   Elution Buffer: -20℃保存。一度融解した後は室温保存。
   その他:-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機 (1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)

PCR増幅およびバリデーション
  • 1st strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (Advanced Analytical, Cat. No. DNF-474)
  • Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit (Agilent, Cat. No. 5067-1504)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)
  • Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600) またはLoBond tubes (Eppendorf, No.022431021)

SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit(5 ml; Beckman Coulter社; 5 ml, Code. A63880、60 ml, Code. A63881)
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device (Magnetic Separator-PCR Strip :製品コード 635011) など
  • 100% Ethanol

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注意事項
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