高性能なシングルセルからの全ゲノム増幅

PicoPLEX® Single Cell WGA Kit v3

  • 再現性の高い全ゲノム増幅
  • 低いアレルドロップアウト率
  • 3時間以内の超簡単ワークフロー
  • 正確性の高いSNV、CNV解析
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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資料
CLN R300718 RB3718 PicoPLEX® Single Cell WGA Kit v3
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24回 ¥80,000
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CLN R300722 RB3722 PicoPLEX® Single Cell WGA Kit v3
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96回 ¥280,000
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CLN R300723 RB3723 PicoPLEX® Single Cell WGA Kit v3
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480回 ¥1,200,000
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製品説明

PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3(PicoPLEX WGA v3)は、シングルセルからDNAを増幅して再現性の高いライブラリーを作製することが可能である。細胞溶解、プレ増幅に続いて、バックグラウンドの低いPCR増幅を行い、3時間以内にマイクログラムレベルの産物が得られる。
従来のPicoPLEX WGA Kitで可能であった再現性の高いコピー数多型(CNV)解析に加えて、本キットでは、正確性の高い増幅用酵素を使用することにより増幅エラーを最小限に抑え、一塩基変異体(SNV)の検出が可能である。
使用できるインプットの種類;
  • 哺乳類細胞(1~10細胞)
  • 精製DNA(15~60 pg DNA)
  • ソートされた染色体
  • インタクトまたは断片化された一本鎖または二本鎖DNA
PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3 テクノロジー
図1.PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3 テクノロジー

表1.PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3を使用したターゲットSNVの正確な検出
Depth of SNV position ≧10
Allele frequency ≧20%
PicoPLEX WGA v3
1 cell
PicoPLEX WGA v3
5 cells
A社
1 cell
A社
5 cells
B社
1 cell
B社
5 cells
  Bulk Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 Rep1 Rep2
Number of SNVs called 74 57 67 69 67 34 57 62 67 Failed Failed 40 Failed
Number of false positives   3 1 0 1 5 1 0 7 Failed Failed 0 Failed
Average false positives 0.02% 0.005% 0.03% 0.035% Failed 0 Failed
Call rate 78% 92% 95% 92% 47% 78% 85% 92% Failed Failed 55% Failed
Average call rate 85% 93% 62% 88% Failed 55% Failed
Missed 17 7 5 7 40 17 12 7 Failed Failed 34 Failed
Average locus dropouts 16.2% 8.1% 38.5% 12.8% Failed 45.9% Failed
Number of heterozygous SNVs called 45 45 38 45 45 36 31 38 41 Failed Failed 32 Failed
Average allele dropouts   7.8% 0.0% 25.6% 12.2% Failed 71.1% Failed
PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3を用いて、バルクgDNAコントロールと2種類の他社キット(A社、B社)を用いた場合とのSNV検出を比較した。GM12878細胞株(Coriell Institute)のシングルセルまたは5細胞サンプルからの全ゲノム増幅産物を2連で調製し、検出されたSNVの数と割合を示した。B社キットでは十分な増幅産物を得られたが、5細胞のサンプルの片方のみがシーケンスするのに十分なアンプリコンを含んでいて、他のサンプルのデータはシーケンスできなかった。Genome In a Bottle(GIB)とhg19(human genome assembly GRCh37、Ensembl)のデータベースの共通部分から、GM12879細胞株におけるバリアントは合計78個存在することが予想される。アンプリコンの設計により、2×75 bpの読取長では短く、78個のSNVのうち4個はキャプチャできなかった。そのため、キャプチャ可能なSNVの総数は74になった。VarDict(バリアントコーラー)を使用して、SNV depth≧10リード(10Xカバレッジ)およびアレル頻度≧20%の基準でBAMファイルからSNVを解析した。PicoPLEX WGA v3は、他社の2種類のキットよりSNVコールレートが高く、アレルドロップアウトも低い割合を示した。
PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3によるCNV検出
図2.PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3によるCNV検出

PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3を使用して、さまざまな細胞株(GM22601、GM05067、GM12878)のシングルセルからゲノムを増幅した。精製した増幅産物 1 ngをIllumina Nextera XT Kitのインプットサンプルとして使用し、2×75 bpの読み取り長でIllumina MiSeqでシーケンスを行った。Fastqファイルは、アダプター配列を除去するためにトリミングされ、human genome assembly GRCh37にアライメントされた。常染色体のみが報告された。アライメントは1Mリードにノーマライズされ、1 MBのbinあたりのリード数はbedtools 2.25.0を使用して計算された。bin数のlog2比(サンプル/リファレンス)は、Integrative Genomics Viewer(IGV)を使用してプロットされた。PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3は染色体の部分的異数性も高解像度で解析できることが示された。


PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3、A社およびB社キットとの全ゲノムカバレッジの再現性の比較
図3.PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3、A社およびB社キットとの全ゲノムカバレッジの再現性の比較

PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3、A社、およびB社(MDA)キットを使用して、GM12878のシングルセルサンプルから2連で増幅産物を調製した。Illumina Nextera XT Kit のインプットサンプルとして増幅産物1 ngを使用し、ライブラリーを作製後、2×75 bpの読み取り長でIllumina MiSeqでシーケンスを行った。Human genome assembly GRCh37へのリードアライメントと100万リード(50万リードペア)へのノーマライズ後、1 Mbのbinあたりのリード数をbedtools 2.25.0を使用して計算した。2つのシングルセルライブラリーからの各ウィンドウの合計読み取り値をプロットし、ピアソン相関とスピアマン相関を計算して各グラフに示した。
Panel A.外れ値を含むサンプル
  注)比較した各社キットのバイアスが異なり、相関ポイントが除外されていないため、グラフのスケールは異なる。
Panel B.外れ値を除外したサンプル
  PicoPLEX WGA v3は、A社およびB社キットと比較して高い再現性と堅牢なカバレッジを示した。

内容

  • Cell Extraction Buffer
  • Extraction Enzyme Dilution Buffer
  • Cell Extraction Enzyme
  • Pre-Amplification Buffer
  • Pre-Amplification Enzyme
  • Amplification Buffer
  • Amplification Enzyme
  • Nuclease-Free Water

保存

-20℃

用途

  • NGS、oligonucleotide aCGH、BAC aCGH、またはqPCRによるコピー数多型(CNV)解析
  • 変異検出のためのターゲット濃縮またはアンプリコン濃縮
  • SNPジェノタイピング

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

  • サーマルサイクラー
  • 微量高速遠心機
  • PCRチューブまたは 96-well PCRプレートとシール
  • ピペットチップ
  • PBS (1×PBS free of Mg2+、Ca2+) 細胞洗浄用
  • 80% (v/v) エタノール
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter社, Cat No.A63880)
  • Magnetics beads separator:SMARTer-Seq Magnetic Separator-PCR strip (製品コード 635011)など

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