Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.
Bennett, C. W. et al. Oncotarget (2016) 7, 71013-71035.
この総説では、肺癌で高頻度にみられる2つの変異遺伝子（EGFRおよびMET）の研究における、リキッドバイオプシーとしてのセルフリーDNAの役割と、解析ツールとしての次世代シーケンス（NGS）の役割を分析しています。
Next Generation-Targeted Amplicon Sequencing (NG-TAS): An optimised protocol and computational pipeline for cost-effective profiling of circulating tumour DNA.
Gao, M. et al. Genome Med. (2019) 11:1.
この研究では、低インプット量の循環腫瘍DNA（ctDNA）を用いて、複数の遺伝子のプロファイルを同時に解析するための迅速、柔軟かつ費用対効果に優れた方法を報告しています。NG-TASは、cfDNAに含まれる変異を確実に検出でき、転移癌のモニターに適しています。臨床血漿サンプルでは、ctDNAの量により研究が制限されることが多いですが、この研究では、ThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いて、3 ngという微量のcfDNAから、cfDNAの全ゲノムライブラリーを作製することに成功しました。
High Throughput Preparation of High Quality Sequence-Ready Libraries from Cell-Free DNA (cfDNA)
Horvath, D., Jerome, J. P. ＆ Popkie, A.
このアプリケーションでは、Biomek FXP Automated Workstation（Beckman Coulter社）でのThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いた自動サンプル調製のワークフローを報告しています。このプロトコールにより、1回のランで0.1～10 ngのインプット量のcfDNAから最大96個のIlluminaライブラリーを3時間以内に調製できることが確認されました。シーケンス解析の結果は、自動プロトコールが高い精度および再現性を示し、手動で調製したライブラリーと同程度の高品質のシーケンスメトリクスが得られるとともに、GCバイアスが低く、ウェル間に交差汚染が生じないことを示しています。
Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus. Sci.
Kitzman, J. O. et al. Transl. Med. (2012) 4, 137ra76.
この研究では、妊娠18.5週のヒト胎児のゲノム配列を非侵襲的に決定するため、両親のゲノムのシーケンス解析、母親の全ゲノムハプロタイピング、および母親血漿の読み取り深度の深いシーケンス解析を併用しました。ThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いて母親血漿のライブラリーを調製したところ、シーケンス解析データから、遺伝的に受け継がれる胎児ゲノムの相補配列を高い精度で決定できました。
Cell-free DNA profiling of metastatic prostate cancer reveals microsatellite instability, structural rearrangements and clonal hematopoiesis.
Mayrhofer, M. et al. Genome Med. (2018) 10, 85-98.
この研究は、セルフリーDNAが癌の診断、予後予測、およびマーカー特定に実用可能であることを示しています。血漿サンプル中のセルフリーDNAの使用は、組織生検の採取と比較して侵襲性が大幅に低く、癌の進行状況の確認での実用性がより高い手法として極めて有望です。著者らは読み取り深度の浅い全ゲノムシーケンス解析を実施したほか、特定領域を深い読み取り深度で解析するため、ターゲット濃縮を行いました。これらの研究にインプットDNA量として0.1～50 ngのセルフリーDNAを使用しました。
Detection of cell free DNA fragmentation and copy number alterations in cerebrospinal fluid from glioma patients.
Mouliere, F. et al. EMBO (2018) 12, e9323.
この記事ではシーケンス解析のコストという重要な問題の解決に役立つアッセイ法を報告しています。コピー数多型およびDNA断片化の解析に必要な読み取り深度は、突然変異の解析に必要な深度と比較して大幅に低いものです。著者らは、低コストのスクリーニングを実施し、候補サンプルを確実に検出した後、疾患を有する可能性が高い患者のみを対象として、読み取り深度およびコストがより高いシーケンス解析による追加検査を実施することができました。このアプローチは、他の疾患や他の種類の癌にも応用できる可能性があります。
Selecting Short DNA Fragments In Plasma Improves Detection Of Circulating Tumour DNA.
Mouliere, F. et al. bioRxiv (2017) 134437.
この記事では再発性かつ高悪性度の漿液性卵巣癌患者13例を対象として、化学療法の施行前および施行中に採取した血漿サンプル中のctDNAを、サイズセレクションによる濃縮が可能かを検討しました。ThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いて、ターゲットおよび全ゲノムのシーケンス解析用のインデックス付きライブラリーを調製しました。解析前にDNA断片を90～150 bpでサイズ選択したところ、変異DNA断片が最大11倍濃縮され、非濃縮条件で検出されなかった有害なコピー数変化（MYC増幅など）を検出できました。
Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.
Murtaza, M. et al. Nature (2013) 497, 108-112.
この研究では、治療による転移癌のゲノム進化を追跡する目的で、進行癌（乳癌、卵巣癌および肺癌）患者6例を対象として、連続採取した血漿サンプルに含まれる癌細胞のエクソームシーケンス解析を実施しました。これらの血漿サンプルから、ThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いて、インデックス付きのシーケンス解析用ライブラリーを調製しました。これらの症例のうち2例で実施された同時生検により、血漿中の腫瘍細胞ゲノムのゲノムワイドな表現が確認されました。変異アレル頻度の上昇に伴って治療抵抗性が出現したことから、循環腫瘍DNAの全エクソーム解析は、進行癌での薬剤抵抗性発現に関連する変異同定に現在使用されている侵襲的な生検を補完する方法として使用できることが実証されました。
Association Of Plasma And Urinary Mutant DNA With Clinical Outcomes In Muscle Invasive Bladder Cancer.
Patel, K. M. et al. Sci. Rep. (2017) 7, 5554.
著者らは、ネオアジュバント化学療法（NAC）を施行中の筋層浸潤膀胱癌患者17例のリキッドバイオプシー（血漿、尿沈渣中の細胞ペレットおよび上清など）248サンプルを採取しました。10 ngのインプット量でThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いてライブラリーを調製し、タグを含むアンプリコンシーケンスおよび読み取り深度の浅い全ゲノムシーケンス解析を用いて、体液中の変異DNA（mutDNA）の一塩基変異およびコピー数変化を評価しました。mutDNAの縦断的解析では、NACによる選択圧下で腫瘍が進化すること、また、NAC施行中にmutDNAが持続的に検出されることは癌再発の予測因子であることが示され、このことから、mutDNAが化学療法の効果の早期バイオマーカーとして有望であることが浮き彫りになりました。
The influence of SNP-based chromosomal microarray and NIPT on the diagnostic yield in 10,000 fetuses with and without fetal ultrasound anomalies.
Srebniak, M. I. et al. Hum. Mutat. (2017) 38, 880-888.
この研究ではSNPアレイ解析および非侵襲性出生前検査（NIPT）が診断率および侵襲性検査件数に与える影響が、Erasmus 大學医療センターロッテルダムの臨床遺伝学科で評価されました。2009～2015年に出生前検査に紹介された10,005症例を対象として、胎児の病的な不均衡型染色体異常の頻度を評価しました。SNPマイクロアレイ解析と、ThruPLEX Plasma-Seq Kitを用いてサンプルあたり1 ngのcfDNAからシーケンス用ライブラリー調製を導入した結果、超顕微鏡的な病的染色体異常の検出率が、超音波異常がみられる胎児で3.6％上昇し、超音波異常がみられない胎児で1.9％上昇しました。
Circulating tumor DNA as a liquid biopsy target for detection of pancreatic cancer.
Takai, E. ＆ Yachida, S. World J. Gastroenterol. (2016) 22, 8480-8488.
この総説では、血液を用いた膵癌診断検査の現状と、プレシジョン・メディシンとしてctDNAが有用である可能性について概説しています。ctDNAベースのリキッドバイオプシーを膵癌の早期診断法として実用化するためには、対処すべき課題が残されているものの、標準化されたctDNA解析方法の確立には、ThruPLEX Plasma-Seq Kitを含む新たなテクノロジーが利用可能であり評価する価値があります。
