Anti-Human Platelet GMP-140 (P-selectin/CD62)

Application1：トロンビンによるヒト血小板活性化と間接蛍光抗体法およびフローサイトメトリーによる解析

1.ヒト新鮮クエン酸血漿より血小板を洗浄分離し、PBS（0.1％NaN₃）中に浮遊させる。
2.血小板浮遊液に0～1 Uのトロンビンを添加する（0～1 U/1×10⁷ platelets）
3.室温5分間反応後に終濃度1％となる様にパラホルムアルデヒドを添加し、室温2分間固定。
4.PBSにて洗浄後に各モノクローナル抗体（1μg lgG/1×10⁷ platelets）を添加し、室温30分間反応。
5.PBSにて洗浄後にFITC標識抗マウスIgGを添加し、室温30分間反応。
6.遠心分離にて上清をのぞき、PBSで再懸濁する。
7.フローサイトメトリーアナライザーにて細胞表面の緑色蛍光強度を解析する。

図 トロンビンによるヒト血小板活性化と間接蛍光抗体法およびフローサイトメトリーによる解析
ヒト洗浄血小板に0～1 Uのトロンビン処理を加え活性化させた。トロンビン濃度依存的に血小板表面の蛍光強度が増加している。

Application2：ヒト洗浄血小板SDS-lysate中のGMP-140、GPIb分子のウエスタンブロット法による検出

図 ウェスタンブロットによるGMP-140およびGPIbの検出
ヒト洗浄血小板をSDSサンプル液にて可溶化し、βメルカプトエタノール処理および未処理にてSDS-PAGEにて分離した。泳動後にPVDF膜にブロットし、各モノクローナル抗体により免疫染色した。
PL7-6、WGA-1により血小板中のGMP-140が検出可能であり（非還元条件下のみ）、PL52-4およびWGA-3によりGPIb分子が検出可能であった（還元および非還元条件下）。

Application3：抗GMP-140モノクローナル抗体のトロンビン刺激ヒト血小板への結合強度

図 スキッチャードプロット解析
ヨード I¹²⁵標識したWGA-1およびPL7-6モノクローナル抗体を用いてトロンビン活性化ヒト血小板への結合度をスキッチャードプロット解析した。
WGA-1、PL7-6ともに血小板表面に約8,000サイト/cellの割合で結合し、結合アフィニィティーはWGA-1の方が強い。