形質転換による平滑末端化の確認
操作手順
pTV119N DNAを、BamH I、Pst I で分解した後、アガロース電気泳動を行い、ゲルより切り出して精製する。このDNA500 ngを、Protocolにしたがい平滑末端化およびself circu-larizationを行う。制限酵素の不完全分解によるブランクを下げるために、ライゲーション後、DNAをXba
I で切断する。平滑末端化±でライゲーション前、ライゲーション後およびXba I 切断後のDNAそれぞれを用いて、E. coli JM109 Competent Cellsを形質転換し、X-Gal、IPTGを含むプレート上でコロニーを形成させる。
平滑末端化を行うと、BamH I で切断されたDNA（5'突出末端）は、3'陥没部分に塩基が付加され、Pst I で切断されたDNA（5'陥没末端）は、3'突出部分の塩基が削られる。その両末端がライゲーションすると、もとのpTV119N DNAより18塩基（6アミノ酸）削られるが、lacZのリーディングフレームの枠はあっているので、青色コロニーを生じる。
平滑末端化を行うと、BamH I で切断されたDNA（5'突出末端）は、3'陥没部分に塩基が付加され、Pst I で切断されたDNA（5'陥没末端）は、3'突出部分の塩基が削られる。その両末端がライゲーションすると、もとのpTV119N DNAより18塩基（6アミノ酸）削られるが、lacZのリーディングフレームの枠はあっているので、青色コロニーを生じる。
結果
ライゲーション後、Xba I で切断したときに、平滑末端化を行った場合のみ、青色コロニーが生じており、DNA Blunting Kitにより正しく平滑末端化が行われていることが確認された。
表1 形質転換による平滑末端化の確認
※本実験で使用したコンピテントセルは、2.7×106コロニー/μg pTV119N DNAの形質転換効率を持つ。
図1 pTV119N DNAの形質転換の原理
| 平滑末端化 | 青色コロニー/ μg DNA |
白色コロニー/ μg DNA |
|
| － | ライゲーション前 ライゲーション後 Xba I 切断後 |
4.2×104 1.7×104 0 |
0 7.0×102 0 |
| ＋ | ライゲーション前 ライゲーション後 Xba I 切断後 |
1.2×104 1.0×106 8.7×105 |
0 3.0×104 2.0×104 |
