Kilo-Sequence用 Deletion Kit

pUC119のHinc II siteにpBR322のSsp I -Pvu II 断片（約2.3 kb）をクローニングし、Xba I （5'-突出）、Kpn I（3'-突出）を利用してデレーションミュータントを作製した。5 μgのプラスミドDNAを用い、Deletion Kitの操作にしたがってKlenow Fragmentによる末端修復まで行った後、アガロースゲル電気泳動を行い、3.1～5.4 kbに相当する部分のゲルを7つに切り分けた。それぞれのゲル断片よりDNAを回収後セルフライゲーションを行い、E. coli JM109 Competent Cells（製品コード 9052）に導入して形質転換体を得た。

各プレートに現れた形質転換体のうち数個ずつを選び、プラスミドのサイズを調べて各サイズのクローンを選んだ（図1）。
この方法により、インサート全体をカバーする一連のデレーションミュータントをきわめて短時間で効率よく得ることができた。

図1　サイズ分画法により作製したプラスミド

（Pst I -Sac I 消化） 　　 M：pHY marker 　　 C：デリーション操作を行わなかったプラスミド